Utilización de recombinasas adaptadas para el tratamiento de las infecciones retrovíricas.

Procedimiento para la preparación de un vector de expresión que codifica una recombinasa adaptada,

recombinando dicha recombinasa adaptada secuencias diana asimétricas dentro de la LTR del ADN provírico insertado en el genoma de una célula hospedadora, que comprende las etapas siguientes:

(a) determinar la secuencia de la LTR del ADN provírico, identificando en ella secuencias con homología de por lo menos el 30% con las secuencias de hemisitio izquierdo y de hemisitio derecho de sitios diana conocidos de recombinasas, en el que las secuencias homólogas están separadas por un separador de 5 a 12 nucleótidos, y en el que las secuencias LTR homólogas con mayor homología con un sitio diana conocido representan la secuencia diana asimétrica;

(b) preparar dos secuencias sintéticas, en el que la primera secuencia sintética corresponde a la secuencia de la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) homóloga al hemisitio izquierdo de dicho sitio diana conocido más la secuencia separadora y se denomina "secuencia de hemisitio 1", y en el que la segunda secuencia sintética corresponde a la secuencia separadora más la secuencia de la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) homóloga al hemisitio derecho y se denomina "secuencia de hemisitio 2";

(c) determinar los nucleótidos dentro de las secuencias sintéticas de la etapa (b) que se desvían de las secuencias homólogas de hemisitio izquierdo y hemisitio derecho correspondientes del sitio diana homólogo conocido de la etapa (a);

(d) generar un primer subconjunto de dos secuencias diana basándose en las secuencias sintéticas de la etapa (b), en el que la primera secuencia diana en el primer subconjunto comprende una repetición invertida constituida por la secuencia de hemisitio 1 de la etapa (b) y de la secuencia del hemisitio 1' separadas por la secuencia separadora, y en el que la segunda secuencia diana en el primer subconjunto comprende una repetición invertida constituida por la secuencia de hemisitio 2' y la secuencia del hemisitio 2 de la etapa (b) separada por la secuencia separadora, en el que las secuencias de hemisitio 1' y 2' representan las repeticiones invertidas de las secuencias de hemisitio 1 y 2 respectivas de la etapa (b);

(e) generar un segundo subconjunto de secuencias diana basándose en las secuencias diana en el primer subconjunto de la etapa (d), en el que cada una de las secuencias de hemisitio junto con la secuencia separadora respectiva de las secuencias diana en el primer subconjunto de la etapa (d) se utiliza para generar una secuencia diana independiente del segundo subconjunto formando una repetición invertida basándose en la secuencia de hemisitio seleccionada, de modo que la secuencia separadora separe ambas secuencias formando la repetición invertida, en el que las secuencias de ambas secuencias de hemisitio que se originan a partir de una de las secuencias diana en el primer subconjunto de la etapa (d) se alteran durante su síntesis y antes de utilizar las mismas para generar la repetición invertida proporcionando la secuencia diana completa de manera que en la secuencia de hemisitio izquierdo una parte de los nucleótidos que se desvían de la secuencia de hemisitio homólogo correspondiente del sitio diana conocido de la etapa (a) se sustituye por los nucleótidos naturales encontrados en el sitio diana conocido y en la secuencia del hemisitio derecho el resto de los nucleótidos que se desvían del hemisitio izquierdo homólogo correspondiente se sustituye por los nucleótidos naturales encontrados en el sitio diana conocido, de modo que en ambas secuencias de hemisitio que se originan a partir de una secuencia diana del primer subconjunto de la etapa (d) de manera conjunta todos los nucleótidos que se desvían pueden encontrarse, en tanto que ninguna de dichas secuencias de hemisitio solas comprenden todos los nucleótidos que se desvían;

(f) generar subconjuntos adicionales de secuencias diana partiendo de las secuencias diana en el segundo subconjunto obtenido en la etapa (e) repitiendo paso a paso el procedimiento de la etapa (e) cada vez que se genera un nuevo subconjunto de secuencias diana, hasta que las secuencias de hemisitio que forman las repeticiones invertidas dentro de cada secuencia diana generada contengan uno, dos o tres nucleótidos que se desvían de la secuencia de hemisitio homólogo correspondiente del sitio diana conocido;

(g) aplicar la evolución molecular dirigida a la recombinasa que reconoce el sitio diana homólogo conocido seleccionado en la etapa (a) utilizando las secuencias diana del subconjunto final obtenido en la etapa (f) que contienen uno, dos o tres nucleótidos que se desvían de la secuencia de hemisitio homóloga correspondiente de dicho sitio diana homólogo conocido como sustrato;

(h) mezclar los bancos de recombinasa desarrollados en la etapa (g);

(i) aplicar la evolución molecular dirigida en el banco mezclado obtenido en la etapa (h) utilizando las secuencias diana del subconjunto superior siguiente según la etapa (f);

(j) repetir las etapas (h) e (i) hasta que se consiga por lo menos una recombinasa por evolución molecular dirigida que sea activa en la secuencia diana asimétrica dentro de la LTR del ADN retrovírico de la etapa (a);

(k) aislar el ácido nucleico de por lo menos una recombinasa obtenida en la etapa (j) procedente del banco; y

(l) clonar el ácido nucleico obtenido en la etapa (k) en un vector de expresión adecuado.

Utilización de recombinasas adaptadas para el tratamiento de las infecciones retrovíricas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un vector de expresión que codifica una recombinasa adaptada (tailored) , en la que dicha recombinasa adaptada recombina sitios diana asimétricos dentro de la LTR de ADN provírico de un retrovirus que se inserta en el genoma de una célula hospedadora. Dichas recombinasas adaptadas que reconocen sitios diana asimétricos dentro de la LTR de ADN provírico son medios para escindir el provirus procedente del genoma de la célula hospedadora. La presente invención se refiere más a la utilización de recombinasas adaptadas para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a reducir la carga vírica en un paciente infectado por un retrovirus. Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para optimizar in vitro el tratamiento de una infección retrovírica de un paciente que comprende adaptar (tailoring) recombinasas que reconocen específicamente y recombinan secuencias de sitios diana asimétricos dentro del ADN provírico de los retrovirus, el paciente está infectado.

Antecedentes de la técnica Las infecciones retrovíricas, como por ejemplo las infecciones por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) siguen siendo una de las enfermedades humanas más importantes y más extendidas.

Con respecto al SIDA, aproximadamente 39, 5 millones de personas viven con el VIH, retrovirus causante del SIDA. Datos recientes muestran que incluso en 2006 existían aproximadamente 4, 3 millones de nuevas infecciones en algunas zonas del mundo en las que las tasas de infección han aumentado en más del 50% desde 2004. Además, en 2006, aproximadamente 2, 9 millones de personas murieron de enfermedades relacionadas con el SIDA, según el AIDS Epidemic Update 2006, publicado por la OMS (en diciembre de 2006) .

Los principales objetivos de la terapia antirretrovírica aplicada son una reducción de la mortalidad y la morbilidad relacionada con el VIH, una mejora de la calidad de vida, un restablecimiento y conservación de las funciones inmunológicas y supresión máxima y duradera de la carga vírica. La terapia antirretrovírica actual, más exactamente, los regímenes de tratamiento contra el VIH se basan principalmente en inhibidores enzimáticos de virus y en moléculas que inhiben la fusión virus-célula.

En este sentido se dispone de cuatro clases de medicamentos anti-VIH que se utilizan en el tratamiento del SIDA. Estas clases de fármacos se dirigen a etapas específicas en el proceso de multiplicación del VIH.

Inhibidores de la fusión (IF) son la primera clase de agentes activos, que actúan fuera de las células hospedadoras a fin de impedir que el VIH se fusione con estas células, al introducirse e infectarlas. Existe un planteamiento relacionado para impedir la unión del VIH a la célula diana mediante los receptores CD4 y co-receptores denominados CCR5 o CXCR4 en la superficie de las células diana.

Las otras tres clases de agentes activos actúan dentro de la célula. Los denominados inhibidores nucleosídicos de transcriptasa inversa (INTI) , inhibidores no nucleosídicos de transcriptasa inversa (INNTI) y los inhibidores de proteasa (IP) se utilizan para impedir la multiplicación del virus dentro de las células hospedadoras una vez se han infectado con el VIH.

Son ejemplos de los INTI y INNTI que impiden que el VIH haga una copia de su información genética (produciendo de este modo el denominado ADN provírico) 3TC (lamivudina, Epivir) , abacavir (Ziagen) , AZT (zidovudina, Retrovir) , d4T (estavudina, Zerit) , ddC (zalcitabine, Hivid) , ddl (didanosina, Videx/VidexEC) , FTC (emtricitabine, Emtriva) , Efavirenz (Sustiva) y nevirapina (Vi-ramune) .

Los IP dirigen el VIH enzima proteasa implicado en el montaje del virus. Ejemplos de estos agentes activos son Amprenavir (Agenerase) , atazanavir (Reyataz) , fosamprenavir (Telzir) , indinavir (Crixivan) , lopinavir, nelfinavir (Viracept) , ritonavir (Norvir) y saquinavir (Invirase y Fortovase) .

Un tipo de terapia de combinación utilizada actualmente que implica la utilización de más de un agente activo es la Terapia Antirretrovírica Hiperactiva (TARHA) destinado a la transcriptasa inversa vírica, proteasa y fusión (Gulick et al., 1997; Lalezari et al., 2003) . La aplicación de esta terapia ha dado como resultado la transformación de la infección por VIH-1 en una enfermedad crónica que ha reducido la morbilidad de los individuos infectados.

Un inconveniente, sin embargo, de todas las estrategias actuales del tratamiento es que sólo suprimen el ciclo de vida vírica sin erradicar la infección. El principal obstáculo en estas terapias parece ser la creación de depósitos permanentes del VIH-1, sobre todo en linfocitos T CD4+ en reposo infectados en estado latente (Chun et al., 1998; Finzi et al., 1997) , que requieren TARHA permanente.

Lamentablemente, en un número creciente de pacientes la TARHA permanente está acompañada por efectos secundarios adversos significativos incluyendo la toxicidad mitocondrial, la lipodistrofia, la diabetes mellitus y la

osteoporosis (Dybul et al., 2002) . Toxicidades sustanciales de fármacos a menudo producen adherencia inadecuada, dando como resultado la inhibición insuficiente de la multiplicación del virus. Como consecuencia, están surgiendo nuevas cepas del VIH-1 que son resistentes a tratamientos supresores (Little et al., 2002) . En vista del creciente número de cepas de VIH resistentes son necesarios y se están desarrollando actualmente nuevos agentes activos. Además, para mejorar el control del VIH-1 se están probando más dianas víricas y nuevas estrategias de inhibición (Donzella, 1998; Chiu et al., 2005; Hazuda et al., 2004; Hauber et al., 2005) .

Un planteamiento alternativo en esta materia consiste en dirigir el provirus insertado en el genoma de la célula hospedadora. La escisión del ADN provírico del genoma del hospedador impediría por ejemplo más multiplicación del VIH y difiere de las metodologías actuales en que tiene potencial para erradicar el virus aún latente presente en el genoma del hospedador.

Una clase de proteínas que se consideraron para su utilización en este planteamiento alternativo son las recombinasas específicas de sitio (Flowers et al., 1997) . Las recombinasas específicas de sitio median en una multitud de funciones en la naturaleza desde la reestructuración génica hasta la segregación de genoma, tal como por ejemplo la escisión, la inversión o la integración de unidades definidas de ADN (reseñado en Stark et al., 1992) .

Una de los recombinasas más sencillas y mejor comprendidas es la recombinasa Cre del bacteriófago P1 que resuelve dímeros del genoma en monómeros por recombinación entre dos sitios idénticas de ADN bicatenario de una secuencia determinada (Hoess y Abremski, 1985) . La recombinasa Cre presenta un uso generalizado en la genética del ratón (Nagy, 2000) . La Cre es una proteína de 38 kDa que se la denominó según su función, ya que produce recombinación (Sternberg y Hamilton, 1981) . Un requisito previo para esta recombinación es la alineación de dos sitios de recombinación reconocidos por Cre en orientación antiparalela que a continuación se unen por cuatro subunidades Cre idénticos que se juntan para formar un anillo en el que cada subunidad se pone en contacto con dos subunidades adyacentes y el hemisitio de un sitio de recombinación (Hoess y Abremski, 1985) . El sitio de recombinación reconocido por Cre es una secuencia de ADN bicatenario de 34 pb conocida como loxP (locus of crossing over (x) , P1; Sternberg y Hamilton, 1981) , que es palindrómica con excepción de sus ocho pares de bases más internos (denominados separadores) , que proporcionan direccionalidad al sitio.

Algunos sistemas de recombinación específica de sitio, incluida la función del sistema Cre/loxP sin proteínas accesorias o cofactores y funcionan bajo una amplia variedad de condiciones celulares. Sin embargo, ya que las recombinasas específicas de sitio funcionan mediante interacciones específicas de las subunidades de la enzima recombinasa con sus sitios diana de ADN afín, la utilización de estas enzimas está restringida por el requisito de que las regiones objetivos del ADN deben contener sitios diana colocados apropiadamente (Lewandoski, 2001) . Hasta el momento, no se ha identificado ninguna recombinasa natural que reconozca secuencias retrovíricas naturales como sus secuencias diana de ADN.

1. Procedimiento para la preparación de un vector de expresión que codifica una recombinasa adaptada, recombinando dicha recombinasa adaptada secuencias diana asimétricas dentro de la LTR del ADN provírico insertado en el genoma de una célula hospedadora, que comprende las etapas siguientes:

(a) determinar la secuencia de la LTR del ADN provírico, identificando en ella secuencias con homología de por lo menos el 30% con las secuencias de hemisitio izquierdo y de hemisitio derecho de sitios diana conocidos de recombinasas, en el que las secuencias homólogas están separadas por un separador de 5 a 12 nucleótidos, y en el que las secuencias LTR homólogas con mayor homología con un sitio diana conocido representan la secuencia diana asimétrica;

(b) preparar dos secuencias sintéticas, en el que la primera secuencia sintética corresponde a la secuencia de la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) homóloga al hemisitio izquierdo de dicho sitio diana conocido más la secuencia separadora y se denomina "secuencia de hemisitio 1", y en el que la segunda secuencia sintética corresponde a la secuencia separadora más la secuencia de la secuencia diana asimétrica de la etapa (a) homóloga al hemisitio derecho y se denomina "secuencia de hemisitio 2";

(c) determinar los nucleótidos dentro de las secuencias sintéticas de la etapa (b) que se desvían de las secuencias homólogas de hemisitio izquierdo y hemisitio derecho correspondientes del sitio diana homólogo conocido de la etapa (a) ;

(d) generar un primer subconjunto de dos secuencias diana basándose en las secuencias sintéticas de la etapa (b) , en el que la primera secuencia diana en el primer subconjunto comprende una repetición invertida constituida por la secuencia de hemisitio 1 de la etapa (b) y de la secuencia del hemisitio 1' separadas por la secuencia separadora, y en el que la segunda secuencia diana en el primer subconjunto comprende una repetición invertida constituida por la secuencia de hemisitio 2' y la secuencia del hemisitio 2 de la etapa (b) separada por la secuencia separadora, en el que las secuencias de hemisitio 1' y 2' representan las repeticiones invertidas de las secuencias de hemisitio 1 y 2 respectivas de la etapa (b) ;

(e) generar un segundo subconjunto de secuencias diana basándose en las secuencias diana en el primer subconjunto de la etapa (d) , en el que cada una de las secuencias de hemisitio junto con la secuencia separadora respectiva de las secuencias diana en el primer subconjunto de la etapa (d) se utiliza para generar una secuencia diana independiente del segundo subconjunto formando una repetición invertida basándose en la secuencia de hemisitio seleccionada, de modo que la secuencia separadora separe ambas secuencias formando la repetición invertida, en el que las secuencias de ambas secuencias de hemisitio que se originan a partir de una de las secuencias diana en el primer subconjunto de la etapa (d) se alteran durante su síntesis y antes de utilizar las mismas para generar la repetición invertida proporcionando la secuencia diana completa de manera que en la secuencia de hemisitio izquierdo una parte de los nucleótidos que se desvían de la secuencia de hemisitio homólogo correspondiente del sitio diana conocido de la etapa (a) se sustituye por los nucleótidos naturales encontrados en el sitio diana conocido y en la secuencia del hemisitio derecho el resto de los nucleótidos que se desvían del hemisitio izquierdo homólogo correspondiente se sustituye por los nucleótidos naturales encontrados en el sitio diana conocido, de modo que en ambas secuencias de hemisitio que se originan a partir de una secuencia diana del primer subconjunto de la etapa (d) de manera conjunta todos los nucleótidos que se desvían pueden encontrarse, en tanto que ninguna de dichas secuencias de hemisitio solas comprenden todos los nucleótidos que se desvían;

(f) generar subconjuntos adicionales de secuencias diana partiendo de las secuencias diana en el segundo subconjunto obtenido en la etapa (e) repitiendo paso a paso el procedimiento de la etapa (e) cada vez que se genera un nuevo subconjunto de secuencias diana, hasta que las secuencias de hemisitio que forman las repeticiones invertidas dentro de cada secuencia diana generada contengan uno, dos o tres nucleótidos que se desvían de la secuencia de hemisitio homólogo correspondiente del sitio diana conocido;

(g) aplicar la evolución molecular dirigida a la recombinasa que reconoce el sitio diana homólogo conocido seleccionado en la etapa (a) utilizando las secuencias diana del subconjunto final obtenido en la etapa (f) que contienen uno, dos o tres nucleótidos que se desvían de la secuencia de hemisitio homóloga correspondiente de dicho sitio diana homólogo conocido como sustrato;

(h) mezclar los bancos de recombinasa desarrollados en la etapa (g) ;

(i) aplicar la evolución molecular dirigida en el banco mezclado obtenido en la etapa (h) utilizando las secuencias diana del subconjunto superior siguiente según la etapa (f) ;

(j) repetir las etapas (h) e (i) hasta que se consiga por lo menos una recombinasa por evolución molecular dirigida que sea activa en la secuencia diana asimétrica dentro de la LTR del ADN retrovírico de la etapa (a) ;

(k) aislar el ácido nucleico de por lo menos una recombinasa obtenida en la etapa (j) procedente del banco; y

(l) clonar el ácido nucleico obtenido en la etapa (k) en un vector de expresión adecuado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la recombinasa conocida cuya secuencia diana se utiliza en la etapa (a) y en la que se aplica la evolución molecular dirigida en las etapas (g) e (i) pertenece a la familia de serina integrasas o tirosina integrasas, en el que la recombinasa se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por Cre del fago P1, FLP de levadura y Dre del fago D6.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia diana asimétrica identificada en la etapa (a) está situada tanto en e.

5. LTR como en e.

3. LTR del provirus.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el ADN provírico insertado en el genoma de una célula hospedadora es el ADN de un retrovirus seleccionado de entre el grupo constituido por el virus de tumor de mama de ratón (VTMR) , virus de mono de Mason Pfizer (VMMP) , virus de leucemia de linfocitos T humanos tipo I (VLTH-I) , virus de leucemia de linfocitos T humanos tipo II (VLTH-II) , virus de la leucemia de linfocitos T de simio tipo I (VLTS-I) , virus de la leucemia de linfocitos T de simio tipo II (VLTS II) , virus de la leucemia bovina (VLB) , virus de la leucemia felina (VLFe) y virus de la leucemia murina de Moloney (VLMMo) en el que el retrovirus es preferentemente un lentivirus seleccionado de entre el grupo constituido por virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) , virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2) , virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) , virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) , virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) , virus Maedi-visna (VMV) , virus de la anemia equina infecciosa (VAEI) y virus de la artritis encefalitis caprina (VAEC) .

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la secuencia diana asimétrica identificada en la etapa (a) está situada tanto en e.

5. LTR como en e.

3. LTR de un VIH provirus y presenta preferentemente la secuencia expuesta como SEC ID nº 3.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la evolución molecular dirigida utilizada es la evolución de proteína unida al sustrato.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el vector de expresión utilizado en la etapa (1) se selecciona de entre el grupo constituido por vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores de espumavirus y vectores adenovíricos preferentemente un vector lentivírico seleccionado de entre el grupo constituido por vectores lentivíricos procedentes de VIH-1, VIS, VIF o VAEI.

8. Procedimiento para la preparación de una recombinasa adaptada, en el que dicho procedimiento comprende el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y la etapa adicional que consiste en expresar la recombinasa adaptada o un polipéptido de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de la recombinasa adaptada del ácido nucleico que codifica la recombinasa insertada en el vector de expresión en una célula hospedadora adecuada, en el que la célula hospedadora se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por células bacterianas, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos.

9. Procedimiento para la preparación de una célula madre adulta transformada, en el que dicho procedimiento comprende el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y la etapa adicional de introducción del vector de expresión in vitro en una célula madre adulta adecuada.

10. Ícido nucleico que codifica una recombinasa adaptada, que puede obtenerse por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la recombinasa adaptada recombina secuencias diana asimétricas en el ADN de un provirus insertado en el genoma de una célula hospedadora, que conduce la escisión del provirus desde el genoma de la célula hospedadora , en el que los sitios diana asimétricos son diferentes de los sitios diana de la recombinasa natural, en el que el ácido nucleico presenta por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEC ID nº 2.

11. Ícido nucleico según la reivindicación 10, en el que dicho ácido nucleico que codifica la recombinasa adaptada presenta la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEC ID nº 2.

12. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11.

13. Recombinasa adaptada que puede obtenerse por el procedimiento según la reivindicación 8, en la que la recombinasa adaptada recombina secuencias diana asimétricas en el ADN de un provirus insertado en el genoma de una célula hospedadora, que conduce a la escisión del provirus desde el genoma de la célula hospedadora, en la que los sitios diana asimétricos son diferentes de los sitios diana de la recombinasa natural, en la que la recombinasa adaptada presenta por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID nº 3.

14. Recombinasa adaptada según la reivindicación 13, en la que la recombinasa adaptada presenta la secuencia de

aminoácidos expuesta como SEC ID nº 3.

15. Polipéptido de fusión que comprende una recombinasa adaptada según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que la recombinasa adaptada está unida a un segundo polipéptido.

16. Polipéptido de fusión según la reivindicación 15, en el que el segundo polipéptido comprende un péptido señal, en el que el péptido señal es preferentemente un dominio de transducción de proteínas seleccionado de entre el grupo que comprende el péptido TAT y un péptido de la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia.

17. Célula madre adulta infectada o transfectada con el vector de expresión según la reivindicación 12, en la que dicha célula madre adulta es preferentemente una célula madre del linaje hematopoyético.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además la etapa de preparación del vector de expresión, la proteína, la proteína de fusión o la célula madre adulta como composición farmacéutica para la reducción de la carga vírica en un paciente infectado por un retrovirus, en el que la preparación farmacéutica comprende preferentemente además un vehículo, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables.

19. Composición farmacéutica para su utilización en la reducción de la carga vírica en un paciente infectado por un retrovirus, que comprende un vector de expresión según la reivindicación 12, una recombinasa adaptada según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16,

o una célula madre adulta según la reivindicación 17, en la que el retrovirus es preferentemente un retrovirus seleccionado de entre el grupo constituido por el virus de tumor de mama de ratón (VTMR) , virus de mono de Mason Pfizer (VMMP) , virus de leucemia de linfocitos T humanos tipo I (VLTH-I) , virus de leucemia de linfocitos T humanos tipo II (VLTH-II) , virus de la leucemia linfocitos T de simio tipo I (VLTS-I) , virus de la leucemia de linfocitos T de simio tipo II (VLTS II) , virus de la leucemia bovina (VLB) , virus de la leucemia felina (VLFe) y virus de la leucemia murina de Moloney (VLMMo) o un lentivirus seleccionado de entre el grupo constituido por virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) , virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2) , virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) , virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) , virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) , virus Maedi-visna (VMV) , virus de la anemia equina infecciosa (VAEI) y virus de la artritis encefalitis caprina (VAEC) .

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que la composición farmacéutica está destinada a la administración simultánea con otros agentes activos de la terapia antirretrovírica hiperactiva (TARHA) o a la administración simultánea o posterior a la terapia global de activación inmunitaria o de activación específica de la expresión génica del provirus.

21. Colección de recombinasas adaptadas, en la que los miembros de dicha colección se obtienen cada uno por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la colección comprende el vector de expresión según la reivindicación 12.