Uso de inhibidores enzimáticos de h-PRUNE para la prevención y tratamiento de las metástasis de tumores que sobreexpresan h-PRUNE.

Péptido que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: NIIHGSDSVESAEKEGGGYGRKKRRQRRR(SEQ ID No 10) caracterizado por que es permeable.

Uso de inhibidores enzimáticos de h-PRUNE para la prevención y tratamiento de las metástasis de tumores que sobreexpresan h-PRUNE.

La presente invención se refiere al uso de inhibidores enzimáticos de h-PRUNE para la prevención y tratamiento 5 de las metástasis de tumores que sobreexpresan h-PRUNE, a un método de cribado para dichos inhibidores y un kit de diagnóstico para la detección de las metástasis de éstos.

Más particularmente, la invención se refiere al uso de inhibidores enzimáticos de h-PRUNE para la prevención y tratamiento de las metástasis de tumores de mama, sarcomas, melanomas, neuroblastomas y a un método de cribado para dichos inhibidores de éstos. Además, la invención se refiere a un kit de diagnóstico para las metástasis de dichos tumores.

La proteína PRUNE humana (h-PRUNE) pertenece a la superfamilia DHH, que incluye varias fosfoesterasas, tales como RecJ nuclear de bacterias y las pirofosfatasas de levaduras y bacterias (Aravind et al., 1998) .

La superfamilia DHH puede dividirse en dos grupos principales tomando como base un resto -C-terminal que está muy conservado en cada grupo pero no en los diferentes grupos. Todos los miembros de esta superfamilia

poseen cuatro restos adicionales que contienen residuos de aminoácidos cargados altamente conservados que se prevé que son responsables de enlaces iónicos y que catalizan la fosfoesterificación. La característica principal de éstos es el tercer resto, concretamente DHH (Asp-His-His) , debido al cual se denomina esta familia.

La proteína RecJ es una proteína de reparación del ADN y, junto con otras nucleasas y proteínas bacterianas poco caracterizadas, pertenece al primer grupo; mientras que PRUNE y las polifosfatasas pertenecen al segundo grupo.

El gen PRUNE de Drosophila se caracterizó originalmente tomando como base su fenotipo mutante que muestra un color marronáceo-morado de los ojos debido a la reducción de drosopterinas, a diferencia del ojo rojo brillante de la mosca de tipo salvaje (Timmons et al., 1996) . Aunque los mutantes de PRUNE homocigotos son viables y fértiles, son letales por el desarrollo de tumores pseudo-melanóticos en presencia de al menos una

única copia de la mutación que interfiere con la formación correcta del disco imaginal que resultará en el ala (awd/K-pn; también denominado Killer de PRUNE) .

Los seres humanos codifican hasta ocho ortólogos del gen awd (nm23) , al menos cuatro de los cuales codifican nucleósido difosfato quinasas (NDKP) activas que catalizan la transferencia del grupo fosforilo de un nucleósido trifosfato a un nucleósido difosfato (Lombardi et al., 2000) .

Varios tumores y células altamente proliferativas sobreexpresan el ARNm de nm23-H1 y la proteína de éste y en la mayor parte de los casos esta sobreexpresión está ligada a estadios tempranos de cáncer. El cáncer de mama es una enfermedad compleja que presenta una gestión clínica difícil debido a su heterogeneidad biológica y a su amplio espectro de capacidad de respuesta al tratamiento (Keen et al., 2003) . Un conocimiento mejorado de los mecanismos moleculares subyacentes a la tumorogénesis han permitido la identificación de un

número creciente de biomarcadores que se han correlacionado con varios pronósticos de cáncer en diferentes etapas del desarrollo de la patología, resultando así en la elección del tratamiento terapéutico más adecuado (Keen et al., Domchek et al., 2002) .

Entre los factores de pronóstico bien establecidos usados actualmente en casos de cáncer de mama primario están la implicación de los ganglios linfáticos, examen histológico, tamaño del tumor, estado del receptor de estrógeno y progesterona, índice de proliferación, grado nuclear o histológico (Kuru et al., 2003, Morabito et al., 2003) . Sería útil proporcionar nuevas moléculas implicadas en los procesos posteriores de transformación, invasión y metástasis para usarse como marcadores para el pronóstico de las etapas posteriores en el desarrollo de la patología tumoral.

En el cáncer de mama y los melanomas, la alta expresión de nm23-H1 humana está asociada con un potencial 45 metastásico disminuido (Florenes et al., 1992) . Para el caso específico del cáncer de mama, la diseminación de las metástasis es responsable virtualmente de todas las muertes por cáncer.

Para volverse invasivas, las células tumorales necesitan cambiar sus propiedades adhesivas, perder el contacto con otras células en el tumor primario y establecer nuevos contactos con la matriz extracelular de las células anfitrionas de los tejidos que invaden. En este contexto, la modulación de la actividad proteasa que rodea a las células tumorales juega un papel crítico. Para migrar desde el tumor primario y salir del sistema circulatorio para colonizar órganos secundarios, las células tumorales también necesitan obtener funciones de motilidad.

Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado varios genes supresores de metástasis (Steeg et al., 2003) . En este grupo, se sabe que nm23 induce una disminución de la motilidad celular cuando se sobreexpresa en células de tumor de mama (Freije et al., 1997, Hartsough et al., 2001, Freije et al., 1997) , influye en la 55 colonización independiente de anclaje e induce la diferenciación (Kantor et al., 1993; Leone et al., 1993; Howlett

et al., 1994; Hartsough et al., 1998; Lombardi et al., 2000) . Además, se ha demostrado que una sobreexpresión de nm23-H1 en el clon de línea celular de cáncer de mama agresivo MDA-C100 reduce significativamente su fenotipo metastásico tanto in vitro como in vivo (Hartsough et al., 2000, Mao et al., 2001, Tseng et al., 2001) .

El inventor en un estudio previo ha demostrado la interacción entre h-PRUNE y nm23-H1 y la disrupción de esta interacción por la mutación nm23H1-S120G (Reymond et al., 1999) . Además, se ha descrito que la amplificación de varias copias de h-PRUNE resulta en la inducción de la proliferación celular y los altos niveles de expresión de h-PRUNE, comparado con los niveles moderados o bajos de nm23-H1, se correlacionan con una agresividad incrementada de sarcoma y tumores de carcinoma de mama (Forus et al., 2001) .

De acuerdo con esto, es evidente la necesidad de proporcionar compuestos adecuados para inhibir la actividad enzimática de h-PRUNE para usarse ventajosamente para el tratamiento y prevención de tumores y metástasis de éstos caracterizados por la sobreexpresión de h-PRUNE.

Ahora el autor de la presente invención ha identificado una nueva actividad enzimática de h-PRUNE particularmente correlacionada con metástasis, particularmente de cáncer de mama, y susceptible a inhibición enzimática terapéutica. De hecho, el autor ha descubierto ahora que h-PRUNE posee una actividad fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos con una afinidad preferente por AMPc sobre GMPc como sustratos, que puede suprimirse eficazmente por algunos inhibidores de fosfodiesterasa.

Además, mediante el estudio realizado por el autor de la presente invención, se encontró que la enzima h-PRUNE resulta que está sobreexpresada con una disminución simultánea de la expresión de nm-23 en tumores metastásicos en varios tejidos. Además, se encontró una correlación directa entre la actividad incrementada de PDE de AMPc de h-PRUNE y la motilidad celular, debido a una interacción física proteína-proteína con nm23H1 en un modelo de tumor de mama. Este descubrimiento subraya la interacción entre h-PRUNE y nm23-H1 que resulta en la modificación de la función protectora de nm23-H1 en la proliferación celular y la supresión de los procesos de metástasis tumoral.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, el papel posible de h-PRUNE como marcador potencial independiente para el pronóstico del desarrollo clínico de cáncer de mama se evaluó estudiando la distribución de la expresión de la proteína h-PRUNE y de nm23-H1 en un grupo de pacientes con carcinoma de mama. Particularmente, la sobreexpresión de h-PRUNE, distribuida homogéneamente entre los diferentes casos clínicos analizados, ofrece la posibilidad de un uso ventajoso de la proteína como un marcador de pronóstico independientemente de otros factores tales como, por ejemplo, tipo de tumor, tamaños histológicos, reactividad de los receptores de estrógeno y progesterona, implicación de los ganglios linfáticos. La identificación de un nuevo marcador... [Seguir leyendo]

1. Péptido que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: NIIHGSDSVESAEKEGGGYGRKKRRQRRR (SEQ ID No 10) caracterizado por que es permeable.

2. Péptido que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: NIIHGSDSVESAEKEGGGYGRKKRRQRRR (SEQ ID No 10) y caracterizado por que es permeable y es un inhibidor de la actividad fosfodiesterasa de nucleótido cíclico de h-prune, para uso en el campo médico.

3. Uso del péptido según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para la prevención y tratamiento de metástasis de tumores caracterizados por una sobreexpresión de h-PRUNE.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que los tumores caracterizados por una sobreexpresión de h-PRUNE son carcinoma de mama, sarcoma, neuroblastoma, tumor de próstata, tumor pancreático, tumor de carcinoma de colon, tumor rectal, meduloblastoma, epitelioma, hepatocarcinoma, linfomas de células T o de células B, mieloma y melanoma y tumor pulmonar.

5. Método de cribado para compuestos que inhiben h-PRUNE, que comprende las fases siguientes:

a) selección de al menos un compuesto que inhibe fosfodiesterasa (PDE) , o derivado, análogo estructural o isómero de éste;

b) administración de dicho al menos un compuesto a una concentración entre 0, 05 !M y 10 !M en una línea celular que sobreexpresa h-PRUNE, en el que dicha línea celular es MDA-C100 435 prune #4;

c) análisis cuantitativo de la actividad fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos de h-PRUNE y/o análisis de motilidad celular frente a concentración de dicho la menos un compuesto y quimio-atrayente y selección del compuesto capaz de inhibir dicha actividad fosfodiesterasa entre los valores de 0, 01 a 1 pmol/min-1/!g-1 y/o inhibir dicha motilidad hasta el logro de valores entre 200 y 1.200 células.

6. Método de cribado según la reivindicación 5, en el que el análisis cuantitativo de la etapa c) se realiza por ensayos de hidrólisis del sustrato AMPc y/o GMPc.

7. Método de cribado según la reivindicación 6, en el que el sustrato se usa a una concentración entre 0, 008 !M y 1 !M.

8. Método para la detección in vitro de h-PRUNE en una muestra biológica para diagnóstico de metástasis de tumores caracterizados por una sobreexpresión de h-PRUNE por un ensayo inmunológico que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicha muestra biológica con el anticuerpo monoclonal anti-h-PRUNE capaz de reconocer y unirse selectivamente a la proteína recombinante h-PRUNE, caracterizado porque pertenece a la clase de inmunoglobulinas IgM y porque es producido por el clon 4G3/4 (depositado en el CBA en Génova el 10/12/2004) ;

b) detección del complejo antígeno-anticuerpo;

c) análisis cuantitativo del complejo antígeno-anticuerpo.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicha muestra biológica es una sección de tejido o un fluido biológico.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que dicho anticuerpo anti-h-PRUNE está marcado con un radioisótopo, molécula fluorescente o enzima.

11. Método para la detección in vitro de h-PRUNE según la reivindicación 8, en el que dicha detección y análisis cuantitativo del complejo antígeno-anticuerpo se realizan por análisis de inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, ELISA, inmunotransferencia.

12. Kit de diagnóstico para la detección de h-PRUNE en una muestra biológica para diagnóstico de metástasis de tumores caracterizados por una sobreexpresión de h-PRUNE que comprende el anticuerpo monoclonal anti-h-PRUNE que pertenece a la clase de inmunoglobulinas IgM y es producido por el clon 4G3/4 (depositado en el CBA en Génova el 10/12/2004) .

13. Kit de diagnóstico según la reivindicación 12, en el que los tumores caracterizados por una sobreexpresión de h-PRUNE son carcinoma de mama, sarcoma, neuroblastoma, melanoma.

14. Kit de diagnóstico según la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo monoclonal anti-h-PRUNE está marcado con un radioisótopo, molécula fluorescente o enzima.

15. Anticuerpo monoclonal murino capaz de reconocer y unirse selectivamente a la proteína h-PRUNE recombinante, caracterizado porque pertenece a la clase de inmunoglobulinas IgM y es producido por el clon 4G3/4 (depositado en el CBA en Génova el 10/12/2004) .