Una planta transgénica transformada con un vector de expresión que comprende una racemasa aislado alanina polinucleótido que codifica,

en donde la planta transformada demuestra una mayor resistencia a los nematodos en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

Uso de genes de la alanina racemasa para conferir a las plantas resistencia a los nemátodos Campo de la invención La invención se refiere al control de los nematodos, en particular, el control de los nematodos del quiste de la soja. Se divulgan aquí métodos de producción de plantas transgénicas con mayor resistencia a los nematodos, vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican para proteínas funcionales, y plantas transgénicas y semillas generadas a partir de los mismos.

Antecedentes de la invención Los nematodos son gusanos microscópicos que se alimentan de las raíces, hojas y tallos de más de 2.000 vegetales, frutas y plantas ornamentales, causando una pérdida estimada de cultivos por valor de $ 100 mil millones en todo el mundo. Un tipo común de nematodo es el nematodo agallador (RKN) , cuya alimentación provoca las características agallas sobre las raíces en una amplia variedad de especies de plantas. Otros nemátodos que se alimentan de raíces son los que forman quistes y lesiones, que son más específico del huésped.

Los nematodos están presentes en todos los Estados Unidos, pero son sobre todo un problema en áreas cálidas y húmedas del sur y el oeste, y en suelos arenosos. El nematodo del quiste de la soja (SCN) , Heterodera glycines, fue descubierto por primera vez en los Estados Unidos en Carolina del Norte en 1954. Es la plaga más grave de las plantas de soja. Algunas áreas están tan fuertemente infestadas por el SCN que la producción de soja ya no es económicamente posible sin medidas de control. Aunque la soja es el principal cultivo de importancia económica atacado por el SCN, el SCN parasita a unos cincuenta huéspedes en total, incluyendo cultivos de campo, hortalizas, plantas ornamentales y malezas.

Los signos de daño causado por nematodos incluyen retraso del crecimiento y amarillamiento de las hojas y el marchitamiento de las plantas durante periodos de calor. Sin embargo, los nematodos, incluyendo al SCN, pueden causar pérdidas significativas de rendimiento sin síntomas obvios por encima del suelo. Además, las raíces infectadas con el SCN se quedan enanas o atrofiadas. La infestación de nematodos pueden reducir el número de nódulos fijadores de nitrógeno sobre las raíces, y puede hacer que estas sean más susceptibles a los ataques de otros patógenos de las plantas transmitidas por el suelo.

El ciclo de vida del nematodo tiene tres grandes etapas: de huevo, juvenil y adulta. El ciclo de vida varía entre las especies de nematodos. Por ejemplo, el ciclo de vida del SCN por lo general se puede completar en 24 a 30 días en condiciones óptimas mientras que a otras especies les puede tomar hasta un año o más, para completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de temperatura y de humedad se tornan adecuados en la primavera, eclosionan en forma de gusanos jóvenes en el suelo. Estos nemátodos en etapa juvenil son los únicos que puede infectar las raíces de la soja.

El ciclo de vida del SCN ha sido objeto de muchos estudios y por lo tanto puede ser utilizado como un ejemplo para la comprensión del ciclo de vida de un nemátodo. Después de penetrar en las raíces de la soja, los SCN juveniles se mueven a través de la raíz hasta que se ponen en contacto con el tejido vascular, donde se detienen y comienzan a alimentarse. El nematodo inyecta secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz se transforma morfológicamente en grandes sincitios multinucleados (o células gigantes en el caso del RKN) , que son utilizados como fuente de nutrientes por los nematodos. Los nematodos se alimentan activamente robando así nutrientes esenciales de la planta lo que resulta en la pérdida de rendimiento. A medida que se alimentan los nematodos, se hinchan y eventualmente los nematodos hembra llegan a ser tan grandes que se rompen a través del tejido de la raíz y quedan expuestos sobre la superficie de la raíz.

Los nematodos SCN macho, que no se hinchan en etapa adulta, migrar fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas en forma de limón. Los machos mueren luego, mientras que las hembras permanecen adheridas a las raíces y continúan alimentándose. Los huevos de las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco de huevos fuera del cuerpo, y más tarde dentro de la cavidad corporal. Eventualmente, toda la cavidad corporal de la hembra adulta está llena de huevos, y el nematodo hembra muere. Es el cuerpo lleno de huevo de la hembra muerta lo que se conoce como el quiste. Los quistes eventualmente desalojan la raíz y se encuentran libres en el suelo. Las paredes del quiste se hacen muy duras, proporcionando una excelente protección para los aproximadamente 200 a 400 huevos que contiene. Los huevos del SCN sobreviven dentro del quiste hasta que se presentan condiciones adecuadas para la eclosión. Aunque muchos de los huevos pueden eclosionar durante el primer año, muchos de ellos también pueden sobrevivir dentro de los quistes durante varios años.

Los nematodos pueden moverse a través del suelo únicamente unas pocas pulgadas por año por sus propios medios. Sin embargo, infestación por nematodos se puede expandir distancias significativas en una variedad de formas. Cualquier cosa que pueda mover el suelo infestado es capaz de propagar la infestación, incluida la maquinaria agrícola, vehículos y herramientas, viento, agua, animales, y los trabajadores agrícolas. Partículas del suelo del tamaño de las semillas a menudo contaminan a la semilla cosechada. En consecuencia, la infestación de nematodos se puede propagar cuando la semilla contaminada de los campos infestados se siembra en campos no infestados. Incluso, existe evidencia de que ciertas especies de nematodos pueden ser esparcidas por las aves. Sólo algunas de estas causas pueden ser prevenidas.

Las prácticas tradicionales de manejo de infestación por nematodos incluyen: el mantenimiento apropiado de los nutrientes del suelo y los niveles de pH del suelo en tierras infestadas con nematodos; el control de otras enfermedades de las plantas, así como de las plagas de insectos y de malas hierbas; la utilización de prácticas de saneamiento tales como el arado, la siembra y el cultivo de los campos infestados con nematodos sólo después del laboreo de los campos no infestadas; limpieza completa de los equipos con agua a alta presión o vapor de agua después de trabajar en los campos infestados; no utilizar semillas cultivadas en tierras infestadas para la siembra de campos no infestados, a menos que la semilla haya sido correctamente limpiada; rotación de los campos infestados y alternación de los cultivos huéspedes con los cultivos no huéspedes; uso de nematicidas; y la siembra de variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de las plantas con el fin de conferirles una mayor resistencia a los nematodos que parasitan las plantas. Las Patentes de Los Estados Unidos Nos. 5.589.622 y 5.824.876 están dirigidas a la identificación de genes de las plantas que se expresan específicamente en o cerca al sitio de alimentación de la planta después de la fijación por el nematodo.

La alanina racemasa (EC 5.1.1.1) cataliza la interconversión de los enantiómeros L y D de alanina y representa el primer paso implicado en la biosíntesis de la pared celular bacteriana. La D-alanina es un componente esencial del peptidoglicano de la pared celular (mureína) en todas las bacterias y es producido por la racemización de L-alanina. La actividad de la alanina racemasa en E. coli es debida a dos productos génicos distintos. Una alanina racemasa (Alr) es constitutiva / poco abundante y es codificada por Alr (Neidhardt et al., J. Biol.. Chem. 1989, 15: 264 (5) : 2393

- 6) . La otra alanina racemasa, DadX, es inducida por D-alanina o L-alanina y reprimida por glucosa y es codificada por el gen para DadX (Hennig et al., Mol Gen Genet 1985, 198 (2) : 315 - 22) .

No obstante lo anterior, existe la necesidad de identificar composiciones seguras y efectivas y métodos para el control de los nematodos que parasitan las plantas, y para la producción de plantas que tengan mayor resistencia a los nematodos que parasitan las plantas.

Resumen de la invención Los presentes inventores encontraron que la expresión de un transgén que comprende un gen para racemasa alanina en una planta puede conferirle a la planta resistencia a los nematodos. La presente invención proporciona plantas transgénicas y semillas, y métodos para superar, o al menos aliviar, la infestación... [Seguir leyendo]

1. Una planta transgénica transformada con un vector de expresión que comprende una racemasa aislado alanina polinucleótido que codifica, en donde la planta transformada demuestra una mayor resistencia a los nematodos en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

2. La planta transgénica de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido aislado se selecciona del grupo constituido por: a) un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7;

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; c) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se define en SEQ ID NO; 5 o 7;

d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% secuencia identidad de un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6uo 8; e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7;

f) un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones estrictas a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en cualquiera de SEQ ID

NOS: 12 a 44, y h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia tal como se define en cualquiera de SEQ ID NO: 12 a 44.

3. La planta de la reivindicación 1, define además como una monocotiledónea o una dicotiledónea.

4. La planta de la reivindicación 1, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, sorgo, plátano, ballico, guisante, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, patata, algodón, tabaco, pimiento, colza, remolacha, col, coliflor, brócoli, lechuga y Arabidopsis thaliana.

5. Una semilla que es cierto para la cría un transgén que comprende un polinucleótido que codifica alanina racemasa, en donde la expresión del polinucleótido confiere una mayor resistencia a los nematodos de la planta producida a partir de la semilla.

6. La semilla de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por: a) un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; c) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido que tiene la secuencia de

aminoácidos tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7;

d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia a un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7;

f) un polinucleótido que se hibrida en estricta de condiciones a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en cualquiera de SEQ ID

NO: 12 a 44, y h) polinucleótido una que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia tal como se define en cualquiera de SEQ ID NO: 12 a 44.

7. Uso de un vector de expresión que comprende un elemento regulador de la transcripción unido operativamente a un polinucleótido que codifica alanina racemasa, en donde la expresión del polinucleótido confiere una mayor resistencia a los nematodos de una planta.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por: a) un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; c) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia a un polinucleótido que tiene una secuencia

tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en la SEQ ID NO: 6 u 8; e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7, y

f) un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones estrictas a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en cualquiera de SEQ ID

NO: 12 a 44, yun h) polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia tal como se define en cualquiera de SEQ ID NO: 12 a 44.

9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en el que el elemento regulador de la transcripción es un promotor de regulación de la expresión específica de raíz o sincitios específica del polinucleótido.

10. Un método para producir una planta transgénica de haber aumentado la resistencia a nematodos, en donde el método comprende las etapas de:

a) introducir en la planta del vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica alanina racemasa, y b) la selección de plantas transgénicas con mayor resistencia a los nematodos.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la planta es una monocotiledónea.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, sorgo, plátano, y ballico.

13. El método de la reivindicación 10, en el que la planta es una dicotiledónea.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la planta se selecciona del grupo que consiste de arveja, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, papa, algodón, tabaco, pimienta, semillas de colza, remolacha, col, coliflor, brócoli, lechuga y Arabidopsis thaliana.

15. El método de la reivindicación 10, en el que el polinucleótido tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 5 o 7.

16. El método de la reivindicación 10 en el que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO: 6 u 8.

Proteína DadX

DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX DadX

Porcentaje de identidad de aminoácidos

100.00% 99, 70% 99, 20% 99, 40% 99, 20% 99, 20% 99, 20% 98, 90% 98, 90% 99, 20% 98, 90% 98, 90% 98, 90% 98, 00% 90, 40% 89, 30% 85, 70% 85, 70% 73, 60% 80, 10%

No. de acceso del homólogo

NP 415708 ZP_00705413 NP 287429 YP_540389 ZP _00734403 ZP_00703512 YP_688709 YP _310139 ZP 00714931 AAC61705 NP 707087 ZP 00725784 AAC36881 NP_753544 ZP 00699231 NP 309712 YP_216782 NP_460758 NP 456309 ZP 01590546

Figura 1

Nombre del gen

alanina racemasa [K12 de Escherichia coli] alanina racemasa [HS de Escherichia coli] alanina racemasa [Escherichia coli] alanina racemasa 2, catabólica [Escherichia coli] alanina racemasa [53638 de Escherichia coli] alanina racemasa [E24377A de Escherichia coli] alanina racemasa 2, catabólica [cepa 8401 de Shigella flexneri 5] alanina racemasa 2, catabólica [Ss046 de Shigella sonnei] alanina racemasa [B7A de Escherichia coli] alanina racemasa [Escherichia coli] alanina racemasa [cepa 301 de Shigella flexneri 2a] alanina racemasa [F11 de Escherichia coli] alanina racemasa catabólica alanina racemasa [CFT073 de Escherichia coli] alanina racemasa [BS512 de Shigella boydii] alanina racemasa [cepa Sakai 0157:H7 de Escherichia coli] alanina racemasa [subespecie de Salmonella entérica] alanina racemasa [LT2 de Salmonella typhimurium] alanina racemasa [subespecie de Salmonella entérica] alanina racemasa [Enterobacter sp. 638]

Proteína Alr

Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Alr Porcentaje de identidad de aminoácidos 99, 40% 99, 40% 99, 70% 99, 70% 99, 70% 99, 70% 99, 70% 99, 20% 98, 10% 98, 90% 97, 50% 93, 90% 91, 10% 89, 70%

Figura 3

ADN para DadX (SEQ ID NO: 5)

Proteína DadX (SEQ ID NO: 6)

Figura 4

ADN para Alr (SEQ ID NO: 7)

Proteína Alr (SEQ ID NO: 8)

Figura 5a Promotor MtN3 (SEQ ID NO: 9)

Promotor POX (SEQ ID NO: 10)

Figura 5b

Promotor TPP (SEQ ID NO: 11)