Un método para obtener o mantener células madre pluripotentes no embrionarias,

que comprende poner en contacto células hematopoyéticas CD34+/CD38+ que tienen la glicoproteína ACA anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) con un anticuerpo anti GPI-ACA.

Uso de anticuerpos anti glicoproteina ACA para obtener/mantener celulas madre pluripotentes no embrionarias.

La presente invencion se refiere al uso de una glicoproteina ACA o un activador de ACA anclado a glicosilfosfatidil inositol (GPI) para obtener celulas madre pluripotentes no embrionarias o para mantener el fenotipo pluripotente de celulas madre no embrionarias. Las celulas madre embrionarias (ES) son el arquetipo de celula madre, capaces de diferenciarse para formar el espectro completo de las diferentes celulas que se encuentran en el organismo adulto. Las mencionadas celulas se describen como pluripotentes ya que son capaces de diferenciarse en muchos tipos celulares. Aunque las ES han sido aisladas de tejidos embrionarios humanos, su uso en Investigacion y con fines terapeuticos esta restringido debido a consideraciones eticas. Las celulas madre tambien existen en la mayoria de los tejidos adultos incluyendose celulas madre del tejido hematopoyetico, neural, gastrointestinal, epidermico, hepatico y mesenquimal. Sin embargo, estas celulas madre tienen menor capacidad de auto-renovacion y una capacidad mas restringida para la diferenciacion, es decir no son pluripotentes. Hasta hace poco, se pensaba que las celulas madre especificas de tejido podian diferenciarse unicamente en celulas del tejido de origen. Sin embargo, estudios recientes sugieren que las celulas madre especificas de tejido pueden diferenciarse a linajes diferentes del tejido de origen. Despues del trasplante de medula osea o de celulas madre hematopoyeticas (HSC) enriquecidas, se han detectado celulas del donante, como mioblastos oseos, mioblastos cardiacos, endotelio, hepatico y del epitelio del conducto biliar, pulmon, Intestinos y tejido epitelial, asi como celulas del neuroectodermo. Algunos estudios han demostrado que las celulas madre neurales asi como celulas musculares pueden diferenciarse a celulas hematopoyeticas. Cuando estas celulas son inyectadas en el blastocisto, las celulas madre neurales contribuyen a la formacion de diferentes tejidos del embrion quimerico de raton. Sin embargo, los estudios llevados a cabo hasta ahora no han podido demostrar definitivamente que las celulas madre especificas de tejido se puedan diferenciar a celulas funcionales de diferentes tejidos, y por tanto ser pluripotentes. En resumen, aunque hay una gran necesidad de generar celulas madre humanas no embrionarias pluripotentes (celulas madre adultas) , todavia no se han solucionado los problemas asociados al cultivo estable a largo plazo para la propagacion de estas celulas madre, incluyendo el problema de la falta de pluripotencia. Asi pues, el problema tecnico subyacente a la presente invencion es proporcionar las bases para obtener y mantener celulas madre no embrionarias pluripotentes. La solucion al mencionado problema tecnico se ha alcanzado proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Sorprendentemente, se ha encontrado que la activacion de ACA, una glicoproteina de superficie anclada a GPI, es suficiente para mantener el fenotipo pluripotente de las celulas madre hematopoyeticas humanas. ACA es una glicoproteina de membrana de 65 kD con una excepcional estructura diacilglicerol de anclaje lipidico especifica para fosfatidilinositol y sensible a fosfolipasa C (PI-PLC) sensible a diacilglicerol de anclaje lipidico, aislado previamente de eritrocitos humanos (Becker-Kojlc' and Terness, J. Biol. Chem. 2002; 277:40472-40478; EP-A1 1 391-463) . En los estudios que dieron como resultado la presente invencion se generaron anticuerpos policlonales de conejo, asi como monoclonales de raton para la proteina purificada y que se emplearon para realizar estudios de expresion de la proteina ACA en celulas de sangre periferica mediante citometria de flujo en uno o dos colores. Los resultados mostraron que esta proteina esta presente en granulocitos, monocitos, linfocitos B pero no en Celulas T. De forma aun mas importante, un subconjunto de celulas madre o progenitoras de medula osea CD34+/CD38- tambien alberga ACA. Esta claro que en celulas proliferativas, especialmente aquellas de origen maligno, ACA induce potentes serales necesarias para la proliferacion celular. Esta propiedad funcional esta en linea con la estructura bioquimica de anclaje, la cual inserta ACA en la membrana celular. Los derivados glicerolipidicos de ACA, resultantes de la hidrolisis con fosfolipasas endogenas e o D tales como inositolglicanos, diacilglicerol, fosfolipidos y acido fosfatidico, son intermedos bien conocidos en los eventos de seralizacion de membrana y activan la cascada de segundos mensajeros intracelulares. Se ha proporcionado fuerte evidencia en los ultimos aros de las "balsas lipidicas", que son plataformas organizacionales basadas en lipidos que contienen proteinas unidas a GPI, tirosina kinasas y lipidos en la membrana de celulas vivas, y que juegan un papel relevante en muchos procesos celulares. El entrecruzamiento de algunas proteinas unidas a GPI induce la regulacion cadena arriba de proteinas de superficie asociadas a la activacion y produccion de citoquinas que promueven el crecimiento celular. Los experimentos ilustrados mas abajo esclarecen la (s) putativa (s) nueva (s) via (s) de transduccion de seral especificas (s) para ACA involucrada en el mantenimiento de la capacidad de auto-renovacion de las celulas madre humanas hematopoyeticas. Las celulas madre humanas hematopoyeticas (=HSC) se caracterizan por la doble capacidad de auto-renovarse y de diferenciarse en progenitores de multiples celulas sanguineas. Estas dos caracteristicas requieren que las HSC experimenten divisiones asimetricas para generar celulas que mantengan una larga hematopoyesis por un lado, asi como una variedad de celulas hijas con diferentes linajes sanguineos, por otro lado. Las celulas CD34+/CD38- que se dividen asimetricamente dan lugar a mas colonias que las CD34+/CD38+ que muestran division simetrica. De forma remarcable, despues de una ligacion de ACA a la membrana celular inducida por anticuerpo, la poblacion de celulas progenitoras CD34+/CD38+ evoluciona hacia celulas divididas asimetricamente, indicando claramente la competencia de la proteina ACA en la seralizacion. Celulas mononucleares aisladas de celulas de cordon umbilical despues de la ligacion del anticuerpo a ACA dan lugar a una concentracion mucho mas alta de celulas madre hematopoyeticas y por tanto indica que este podria ser un nuevo metodo para conseguir una poblacion de celulas madre util para la practica clinica.

Breveºeesrrpcrpnnºeeºlosºepbujos

Figura 1. Datos de analisis representativos de la expresion de ACA en poblaciones de celulas madre que fueron separadas en base a la expresion de CD34+/CD38+ y CD34+/CD38-. (A) Control de isotipo, (B) Expresion de ACA en celulas CD34+/CD38+ y CD34+/CD38-.

Figura 2: Imagenes de inmunofluorescencia de celulas CD34+/CD38+ teridas con anticuerpos monoclonales para la glicoproteina ACA humana.

Figura 3: Imagenes de inmunofluorescencia de celulas CD34+/CD38-teridas con anticuerpos monoclonales especificos anti ACA.

Figura 4: Imagenes de inmunofluorescencia de celulas CD34+/CD38+ antes de, y 24 horas despues de, el entrecruzamiento con anticuerpos monoclonales para ACA.

Asi, la presente invencion esta relacionada con el uso de anticuerpo anti-glicoproteina ACA anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) , para obtener celulas madre pluripotentes no embrionarias, para mantener el fenotipo pluripotente de celulas madre no embrionarias o para expandir celulas madre pluripotentes no embrionarias ex vivo, de tal manera que la diferenciacion de dichas celulas se minimice o impida.

Tal como se usa aqui, el termino "celula madre no embrionaria" comprende cualquier celula madre no embrionaria, por ejemplo una celula madre de gonadas o celula madre/progenitoras somatica, tal como celula madre hematopoyetica, celula madre epidermica, celula madre mesenquimal o celula madre neural, prefiriendose una celula madre hematopoyetica. Las fuentes para obtener y/o propagar versiones pluripotentes de las mencionadas celulas son por ejemplo medula osea, sangre periferica, sangre de cordon umbilical, tejido graso, higado, musculo, mioblastos esqueleticos, mioblastos cardiacos, endotelio y epitelio.

Tal como se usa aqui, el termino "glicoproteina ACA anclada a glicosilfosfatidilinositos (GPI) ", se refiere a la proteina natural descrita en Becker-Kojic' and Terness, J. Biol. Chem. 2002; 277:40472-40478; EP-A1 1 391-463.

Tal como se usa aqui, el termino "que la diferenciacion de las mencionadas celulas se minimiza o impide", se refiere a las condiciones de cultivo en las que las celulas madre mantienen el estado de pluripotencia que tenian antes de expandirse.... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para obtener o mantener celulas madre pluripotentes no embrionarias, que comprende poner en

contacto celulas hematopoyeticas CD34+/CD38+ que tienen la glicoproteina ACA anclada a glicosilfosfatidilinositol 5 (GPI) con un anticuerpo anti GPI-ACA.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde dicho anticuerpo anti GPI-ACA es un anticuerpo monoclonal.

3. Metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, donde las celulas son de medula osea, sangre periferica, sangre del 10 cordon umbilical, tejido graso, higado, musculo, mioblastos esqueleticos, mioblastos cardiacos, endotelio o epitelio.

Referenrpas ºrptaeas ºenºla ºeesrrpcrpnn

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es unicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilacion de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Dorumentosºee ºcatentes rptaeosºen ºla eesrrpcrpnn

EP 1391463A1 [0005][0010][0028] DE 19608813 C2 [0012][0013] EP 0695351 81 [0013]

Lpteraturaºepferente ºeeºcatentesºrptaeaºenºla eesrrpcrpnn Berker·Kojpr'; Terness. J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, 40472-40478 [0005] Wahl et al. J. Nucl. Med., 1983, vol. 24.

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