UN MÉTODO PARA LA PREPARACIÓN DE SONDAS PARA LA FORMACIÓN DE IMÁGENES UTILIZANDO QUÍMICA CLIC.

Un método para identificar una sonda candidata para formación de imágenes,

comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera biblioteca de compuestos candidatos con una biomacromolécula objetivo, cada compuesto de la primera biblioteca de compuestos incluye un primer grupo funcional capaz de participar en una reacción de química clic, y cada compuesto exhibiendo opcionalmente afinidad por un primer sitio de enlazamiento de la biomacromolécula objetivo que incluye un primer sitio de enlazamiento y un segundo sitio de enlazamiento;

b) la identificación de un primer miembro de la primera biblioteca de compuestos candidatos que exhiben afinidad por el primer sitio de enlazamiento;

c) poner en contacto al primer miembro identificado a partir de la primera biblioteca de compuestos candidatos que exhiben afinidad por el primer sitio de enlazamiento con la biomacromolécula objetivo;

d) poner en contacto una segunda biblioteca de compuestos candidatos con el primer miembro y la biomacromolécula objetivo, la segunda biblioteca de compuestos candidatos exhibiendo opcionalmente afinidad por el segundo sitio que enlazamiento, en donde cada compuesto de la segunda biblioteca de compuestos candidatos incluye un segundo grupo funcional complementario capaz de participar en una reacción de química clic con el primer grupo funcional, en donde o bien cada compuesto de la primera biblioteca o cada compuesto de la segunda biblioteca, o cada compuesto tanto de la primera como de la segunda biblioteca de compuestos, incluye independientemente un isótopo no radioactivo de un elemento químico y en donde el elemento químico incluye al menos un radioisótopo, opcionalmente unido a través de un enlazador, en donde el isótopo no radioactivo es F-19, y en donde el isótopo radioactivo es F-18;

e) la reacción del segundo grupo funcional complementario con el primer grupo funcional a través de una reacción de química clic inducida por una biomacromolécula para formar la sonda candidata para formación de imágenes;

f) el aislamiento e identificación de la sonda candidata para formación de imágenes;

g) la preparación de la sonda candidata para formación de imágenes por medio de síntesis química; y

h) la conversión de la sonda candidata para formación de imágenes en una sonda para formación de imágenes por medio de la conversión del isótopo no radioactivo del elemento en el isótopo radioactivo F-18.

Un método para la preparación de sondas para la formación de imágenes utilizando química clic.

Campo de la invención La invención se relaciona con el uso de métodos de química clic in situ para cribado de sondas para la formación de imágenes moleculares de alta afinidad Antecedentes de la invención La Tomografía de Emisión de Positrones (PET) es una tecnología molecular de formación de imágenes que es cada vez más utilizada para la detección de enfermedades. Los sistemas de formación de imágenes por PET crean imágenes con base en la distribución de isótopos que emiten positrones en el tejido de un paciente. Típicamente se administran los isótopos a un paciente por medio de la inyección de moléculas sonda que incluyen un isótopo que emite positrones, tal como F-18, C-11, N-13, u O-15, covalentemente unido a una molécula que es fácilmente metabolizada o localizada en el organismo (por ejemplo glucosa) o que se enlaza químicamente sitios receptores dentro del organismo. En algunos casos, se administra el isótopo al paciente como una solución iónica o por medio de inhalación. Una de las sondas más ampliamente utilizadas para la formación de imágenes moleculares por PET marcada con un emisor de positrones es la 2-desoxi-2-[18F]fluoro-D-glucosa ([18F]FDG) .

El cribado por PET utilizando el análogo de glucosa ([18F]FDG) , que ante todo dirige a los transportadores de glucosa, es una herramienta clínica precisa para la detección temprana, determinación del estado, y nueva determinación del estado del cáncer. Se está utilizando cada vez más la formación de imágenes por PET-FDG para controlar la quimioterapia y la quimiorradioterapia contra el cáncer debido a que se ha demostrado que cambios tempranos en la utilización de la glucosa están relacionados con predicciones de los resultados. Un rasgo característico de las células tumorales es su acelerada tasa de glicólisis, que resulta de las altas demandas metabólicas de tejidos tumorales en rápida proliferación. Como la glucosa, la FDG es consumida por las células cancerosas a través de transportadores de glucosa y es fosforilada por hexoquinasa hasta FDG-6 fosfato. Esta última no puede seguir más adelante en la cadena de la glicolisis, o deja la célula debido a su carga, permitiendo detectar las células con altas tasas de glicólisis.

Aunque útil en muchos contextos, también existen limitaciones en la formación de imágenes por FDG-PET para monitoreo del cáncer. La acumulación en tejido inflamatorio limita la especificidad de FDG-PET. Contrariamente, el consumo no específico de FDG puede limitar también la sensibilidad de PET para la predicción de la respuesta por parte del tumor. Se ha demostrado que las reacciones de estrés celular inducidas por la terapia causan un incremento temporal en el consumo de FDG en líneas de células tumorales tratadas por medio de radioterapia y de fármacos quimioterapéuticos. Además, la actividad fisiológica de fondo altamente normal (es decir, en el cerebro) puede hacer que la cuantificación del consumo de FDG relacionada con el cáncer sea imposible en algunas áreas del organismo.

Debido a estas limitaciones, se están desarrollando otros trazadores para la formación de imágenes por PET que apuntan a otras transformaciones medianas por una enzima en tejido canceroso, tales como 6-[F-18]fluoro-L-DOPA para síntesis de dopamina, 3'-[F-18]Fluoro-3'-desoxitimidina (FLT) para replicación del ADN, y [C-11] (metil) colina para colina quinasa, así como actividad específica ultra alta de enlazamiento del receptor-ligando (por ejemplo, 16a [F-18]fluoroestradiol) y potencialmente expresión génica (por ejemplo, [F-18]fluoro-ganciclovir) . Los agentes dirigidos molecularmente han demostrado un gran valor potencial para la formación no invasiva de imágenes por PET en cánceres.

Estos estudios han demostrado el gran valor de la formación de imágenes no invasivas por PET para objetivos metabólicos específicos del cáncer. A pesar del claro valor clínico de la incorporación de la formación de imágenes por PET en el manejo de un paciente, existen limitaciones. En ciertos casos, las sondas actuales para formación de imágenes carecen de especificidad o tienen características inadecuadas de señal con respecto al fondo. Además, nuevos objetivos biológicos que están siendo analizados para intervención terapéutica requerirán de nuevas sondas para formación de imágenes para evaluar el potencial terapéutico.

Se requieren biomarcadores adicionales que muestren una afinidad muy alta hacia, y específicamente para, objetivos tumorales para soportar el desarrollo de fármacos para el cáncer y para proporcionarle a los proveedores que atienden la salud medios para diagnosticar en forma precisa una enfermedad y monitorear el tratamiento. Tales sondas para formación de imágenes podrían mejorar dramáticamente la resolución espacial aparente del escáner para PET, permitiendo detectar tumores más pequeños, y cantidades en nanomoles que son inyectadas en pacientes.

Krasinsky et al. (2005) JACS 127, 6686 - 6692 divulga un proceso para la identificación de un inhibidor para acetilcolinesterasa (AChE) , que comprende la reacción de AChE con un primer ligando (TZ2) , poniendo en contacto al complejo con una biblioteca para la selección in situ de un segundo ligando, y acoplando el primero y el segundo ligandos utilizando química clic. Manetsch et al. (2004) JACS 126, 12809 - 12818, describe un método in situ para la identificación de inhibidores de enzimas que comprende poner en contacto a la AChE con una primera biblioteca de ligandos (TZ2-6, TA1-3) , poner en contacto el complejo con una segunda biblioteca de ligandos (PA2-5, PZ5-8) , permitiendo que tenga lugar una reacción clic entre miembros de la primera y la segunda biblioteca, e identificando los productos formados. EP 0167103 A divulga la preparación de compuestos que contiene 18F para uso en PET, que comprende la transformación de un compuesto de fórmula X-R en 18F-R, en donde X es un grupo nucleofílico saliente, tal como un grupo halo o nitro.

Resumen de la invención La presente invención provee una plataforma tecnológica con base en un enfoque de química clic in situ (Mocharla, V. P.; Colasson, B.; Lee, L. V.; Roeper, S.; Sharpless, K. B.; Wong, C. H.; Kolb, H. C. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 116 - 120) para identificar sondas de PET de alta afinidad que apuntan a macromoléculas biológicas relacionadas con cáncer y con otras enfermedades. Los ligandos de alta afinidad para objetivos biológicos se elaboran a través de química clic in situ, por medio de la cual el objetivo biológico patroniza el montaje de dos fragmentos reactivos dentro de los confines de sus bolsillos de enlazamiento. La marcación radioactiva de los ligandos objetivo generados provee sondas candidatas para la formación de imágenes por PET que pueden permitir el diagnóstico y la identificación de la ubicación del tumor, y puede proveer información del mecanismo sobre el tipo de tumor para tratamiento. Al menos uno de los fragmentos pareados utilizados en el proceso de selección porta un isótopo no radioactivo de un elemento (o elemento químico) que incluye un isótopo radioactivo dentro de su nucleído que es adecuado para uso en sondas para formación de imágenes moleculares (por ejemplo, F-19) como parte de su diseño con el propósito de facilitar la introducción posterior del radionúclido (por ejemplo, F-18) .

En una modalidad, la presente invención identifica una nueva clase de sondas de formación de imágenes moleculares para Anhidrasa carbónica II (CA-II) . Fisiológicamente, CA-II es una de las 14 isozimas conocidas de la familia de la anhidrasa carbónica y se expresa en casi cada órgano y tejido en el organismo. Esto es claramente una reflexión sobre la importancia de su capacidad para catalizar la hidratación reversible del dióxido de carbono en ion bicarbonato. Esta función biológica crítica hace de la CA-II una pieza clave en los procesos que involucran el transporte de HCO3-/CO2 entre tejidos, control del pH, reabsorción ósea y secreción de electrolitos en diferentes epitelios. Hay otros miembros de la familia de CA, específicamente las isozimas CA-IX y CA-XII, que se reporta que son sobreexpresadas en células cancerosas. Aplicando adicionalmente esta tecnología de selección para la identificación de nuevos agentes para formación de imágenes CA-IX y CA-XII, se puede formar exitosamente imágenes de tumores que expresen CA-IX y CA-XII y pueden conducir en última instancia a la identificación y nuevas terapéuticas y regímenes de terapia.

En otra modalidad, se aplicó... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar una sonda candidata para formación de imágenes, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una primera biblioteca de compuestos candidatos con una biomacromolécula objetivo, cada compuesto de la primera biblioteca de compuestos incluye un primer grupo funcional capaz de participar en una reacción de química clic, y cada compuesto exhibiendo opcionalmente afinidad por un primer sitio de enlazamiento de la biomacromolécula objetivo que incluye un primer sitio de enlazamiento y un segundo sitio de enlazamiento;

b) la identificación de un primer miembro de la primera biblioteca de compuestos candidatos que exhiben afinidad por el primer sitio de enlazamiento;

c) poner en contacto al primer miembro identificado a partir de la primera biblioteca de compuestos candidatos que exhiben afinidad por el primer sitio de enlazamiento con la biomacromolécula objetivo;

d) poner en contacto una segunda biblioteca de compuestos candidatos con el primer miembro y la biomacromolécula objetivo, la segunda biblioteca de compuestos candidatos exhibiendo opcionalmente afinidad por el segundo sitio que enlazamiento, en donde cada compuesto de la segunda biblioteca de compuestos candidatos incluye un segundo grupo funcional complementario capaz de participar en una reacción de química clic con el primer grupo funcional, en donde o bien cada compuesto de la primera biblioteca o cada compuesto de la segunda biblioteca, o cada compuesto tanto de la primera como de la segunda biblioteca de compuestos, incluye independientemente un isótopo no radioactivo de un elemento químico y en donde el elemento químico incluye al menos un radioisótopo, opcionalmente unido a través de un enlazador, en donde el isótopo no radioactivo es F-19, y en donde el isótopo radioactivo es F-18;

e) la reacción del segundo grupo funcional complementario con el primer grupo funcional a través de una reacción de química clic inducida por una biomacromolécula para formar la sonda candidata para formación de imágenes;

f) el aislamiento e identificación de la sonda candidata para formación de imágenes;

g) la preparación de la sonda candidata para formación de imágenes por medio de síntesis química; y h) la conversión de la sonda candidata para formación de imágenes en una sonda para formación de imágenes por medio de la conversión del isótopo no radioactivo del elemento en el isótopo radioactivo F-18.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde la biomacromolécula es seleccionada del grupo que consiste de enzimas, receptores, ADN, ARN, canales de iones y anticuerpos.

3. El método de la Reivindicación 1, en donde la biomacromolécula objetivo es una proteína que es sobreexpresada en estados de enfermedad, incluyendo beta-amiloide en tejido cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer.

4. El método de la Reivindicación 1, en donde el segundo sitio de enlazamiento constituye una porción del primer sitio de enlazamiento.

5. El método de la Reivindicación 1, en donde cada compuesto de la primera biblioteca o cada compuesto de la segunda biblioteca, o cada compuesto tanto de la primera como de la segunda biblioteca de compuestos incluyen un fluoróforo.

6. El método de la Reivindicación 1, en donde la reacción de química clic es una reacción de cicloadición.

7. El método de la Reivindicación 6, en donde la reacción de cicloadición se selecciona de entre el grupo que consiste de una reacción de Diels-Alder o una reacción de cicloadición 1, 3-dipolar.

8. El método de la Reivindicación 7, en donde la reacción de cicloadición es una reacción de cicloadición 1, 3-dipolar.

9. El método de la Reivindicación 1, en donde los grupos funcionales complementarios en clic incluyen una azida y un alquino y en donde la reacción clic forma un producto que contiene 1, 2, 3-triazol.

10. El método de la Reivindicación 1, en donde el primer grupo funcional es una azida y el segundo grupo funcional es un alquino, o en donde el primer grupo funcional es un alquino y el segundo grupo funcional es una azida.

11. El método de la Reivindicación 10, en donde el alquino es un alquino terminal.

12. El método de la Reivindicación 1, en donde las etapas de a) hasta f) se llevan a cabo en un procedimiento iterativo de preparación de una nueva primera biblioteca de compuestos y/o una segunda biblioteca de compuestos y se selecciona nuevamente hasta que se identifica una sonda candidata para formación de imágenes con enlazamiento optimizado, biodistribución, metabolismo y propiedades farmacocinéticas.

13. El método de la Reivindicación 12, en donde la sonda candidata identificada para formación de imágenes está marcada con el isótopo radioactivo, y la sonda radioactiva resultante para formación de imágenes es utilizada para un método de formación de imágenes seleccionado de entre el grupo que consiste de PET, SPECT y formación óptica de imágenes.

14. El método de la Reivindicación 1, en donde la biomacromolécula objetivo es una enzima.

15. El método de la Reivindicación 14, en donde la enzima objetivo es seleccionada de entre el grupo que consiste de las sobreexpresadas o sobreactivadas en estados de enfermedad tales como COX-2, AKT, P13K, o CA-9/CA-12.

16. El método de la Reivindicación 14, en donde el primer grupo funcional es una azida y el segundo grupo funcional es un alquino terminal, o en donde el primer grupo funcional es un alquino terminal y el segundo grupo funcional es una azida.

17. El método de la Reivindicación 14, en donde los grupos funcionales complementarios de clic incluyen una azida y un alquino y la reacción clic forma un producto que contiene 1, 2, 3-triazol.

18. El método de la Reivindicación 14, en donde el primer grupo funcional es una azida y el segundo grupo funcional es un alquino, o en donde el primer grupo funcional es un alquino y el segundo grupo funcional es una azida.

19. El método de la Reivindicación 14, en donde las etapas de a) hasta f) se llevan a cabo en un procedimiento iterativo de preparación de una nueva primera biblioteca de compuestos y/o una segunda biblioteca de compuestos y se selecciona nuevamente hasta que se identifica una sonda candidata para formación de imágenes con enlazamiento optimizado, biodistribución, metabolismo y propiedades farmacocinéticas.

20. El método de la Reivindicación 14, en donde el compuesto ligando identificado está marcado con el isótopo radioactivo, y el compuesto ligando resultante es utilizado para un método de formación de imágenes seleccionado de entre el grupo que consiste de PET, SPECT y formación óptica de imágenes.

21. El método de la Reivindicación 14, en donde el enlazamiento de los compuestos candidatos dentro de los sitios de enlazamiento de la enzima facilita la reacción de química clic en ausencia de cualquier catalizador añadido externamente.

22. El método de la Reivindicación 14, en donde la primera biblioteca de compuestos candidatos y/o la segunda biblioteca de compuestos candidatos incluyen además un enlazador entre el compuesto y el primer grupo funcional y/o un enlazador entre el compuesto y el segundo grupo funcional.

23. El método de la Reivindicación 22, en donde el enlazador incluye entre 1 a 10 átomos en la cadena del enlazador entre el compuesto y el grupo funcional.