Procedimiento para la detección magneto-electroquímica sin lavados de un analito en una muestra.

La invención describe un procedimiento rápido, simple y eficaz para la detección magneto-electroquímica de un analito en una muestra eliminando todo paso de lavado,

que comprende la incubación de dicha muestra en presencia de partículas magnéticas y de un elemento de reconocimiento ligado a un enzima en que dicho elemento de reconocimiento y dichas partículas magnéticas son capaces de interaccionar independientemente con dicho analito, la aplicación del electrodo al resultado de esta etapa de incubación en presencia de al menos un imán, la adición de un sustrato electroquímico de dicho enzima para obtener un compuesto con capacidad óxido-reductora, la medición electroquímica en la superficie del electrodo de dicho compuesto con capacidad óxido-reductora o de al menos un producto de una reacción redox generada por dicho compuesto en presencia de los componentes de la muestra, los reactivos añadidos en la incubación y del sustrato electroquímico, y la determinación de la presencia del analito evaluando el resultado de la etapa anterior respecto de una referencia.

Procedimiento para la detección magneto-electroquímica sin lavados de un analito en una muestra

Campo de la Invención

La presente invención refiere a un método para la detección de un analito de tipo biológico y/o químico con aplicación en sensores electroquímicos y nanotecnología en los campos de clínica y biomedicina, bioseguridad e higiene, ambiental, agroalimentario, industrial, farmacológico y biotecnológico en general.

Antecedentes

Los ensayos de afinidad han sido ampliamente utilizados para la detección y cuantificación de analitos por su especificidad, sensibilidad y versatilidad. Se basan en la utilización de elementos de reconocimiento dirigidos a la captura del componente de interés analítico de una muestra, o analito. Resulta además imprescindible el uso de indicadores que señalen que las reacciones de reconocimiento implicadas en el ensayo de afinidad han transcurrido con éxito. Para ello se utilizan "marcas" o reactivos ya marcados, destacando el uso de enzimas debido a su simplicidad, potencialidad y la alta sensibilidad que ofrecen en el desarrollo de metodologías analíticas.

Entre los enzimas más utilizados en la técnica como mareaje se encuentra la fosfatasa alcalina (AP), gracias a su constante tasa de reacción durante prolongados períodos de tiempo y a la formación de conjugados marcados estables. Existe una amplia variedad de sustratos cromogénicos, fluorogénicos y quimioluminiscentes disponibles para este enzima.

Una de las vías más recientes de aplicación del enzima AP en analítica surgió con la utilización de sustratos electroquímicos como el 3-indoxil fosfato (3-IP). Su hidrólisis por el enzima AP genera un compuesto indoxílico intermedio que actúa como agente reductor. De esta forma y como se ilustra en la Fig. 1, la utilización conjunta del 3-IP con una fuente de plata en forma iónica (Ag+) en presencia de AP provoca la formación simultánea de plata metálica (Ag°) (P. Fanjul-Bolado, D. Hernández-Santos, M.B. González-García, A. Costa-García, Anal. Chem., 2007, 79, 5272-5277). Esta plata metálica precipita y se deposita en las zonas adyacentes al mareaje.

El uso de ensayos de afinidad se ha visto limitado en múltiples ocasiones por la imperiosa necesidad de obtener resultados rápidos para un elevado número de muestras, por motivo de diagnóstico y/o bioseguridad. En consecuencia, han ido cobrando gran importancia los métodos de alto caudal y rendimiento que permitan a los laboratorios la realización de rastreos intensivos de manera rápida y fiable. Surgen entonces en el mercado todo un abanico de kits analíticos que aprovechan distintas tecnologías para aportar rapidez y sencillez de análisis. No obstante, se mantienen en ellos una serie de etapas de lavado que requieren un cierto nivel de manipulación y suponen un consumo relevante de tiempo. Esta es una de las principales limitaciones que presentan los ensayos de afinidad, en general.

Los lavados juegan un papel clave en el éxito analítico de un ensayo ya que minimizan las posibles reacciones inespecíficas, al tiempo que facilitan las reacciones de reconocimiento. Su limitación reside en la operatividad, ya que suponen el grueso del consumo de tiempo y carga de trabajo del ensayo.

Entre las metodologías analíticas que han conseguido alcanzar con éxito la eliminación de lavados se encuentran las técnicas "FPIA" o "Fluorescent Polarization Immunoassay"

(Abbott Laboratories, ILL, USA; Enzo Life Sciences Inc., NY, USA; BMG LABTECH GmbH, Germany; K. Nielsen, D. Gall, J. Immunoassay Immunochem., 2001, 22, 183201), la "MSD-ECL" o "Meso Scale Discovery Electrochemiluminiscence" (Meso Scale Diagnostics, Llc, MD, USA; I. Thompson, J. McGiven, J. Sawyer, R. Thirlwall, N. Commander, J. Stack, Clin. Vaccine Immunol., 2009, 16, 765-771), y la "AlphaLISA" o "Amplified Luminiscent Proximity Homogeneous Assay" (PerkinElmer Inc., MA, USA; M. Bielefeld-Sévigny, Assay Drug Dev. Technol., 2009, 7, 90-92).

Por otro lado, en los últimos años se ha aprovechado el magnetismo y sus propiedades para llevar a cabo reconocimientos y lavados de manera eficaz, simple y rápida. Existe en la técnica una amplia gama de partículas magnéticas (MBs) de diferentes cuerpos magnéticos, tamaños, recubrimientos y funcionalizaciones, que juegan un importante papel en los ensayos de afinidad ya que pueden comprender elementos de reconocimiento de afinidad universal como proteínas A o G, estreptavidina, o grupos químicos como carboxilo o tosilo; y/o elementos de alto reconocimiento específico como anticuerpos o sondas de ADN.

El uso de MBs aporta una serie de ventajas por sus propiedades como microesferas magnéticas de baja toxicidad y alta biocompatibilidad:

- elevada superficie activa para la captura del analito;

- facilitación de las reacciones de afinidad al transcurrir en suspensión en lugar de en una fase sólida;

- incremento de penetrabilidad en la matriz de la muestra, permitiendo un mayor acceso al analito;

- versatilidad en cuanto a los posibles volúmenes de muestra a analizar, entre microlitros y litros; y

- facilidad, eficacia y control en la ejecución de los sucesivos pasos de afinidad y etapas de lavado mediante la aplicación externa de campos magnéticos regulados ya sea de manera manual o incluso automatizada.

Estas características son las responsables de que los ensayos de afinidad magnéticos resulten métodos rápidos, sencillos y fiables. El uso de MBs se ha extendido a todo tipo de ensayos de afinidad, separaciones celulares y/o purificaciones sean éstos de carácter inmunológico, genético o proteico, con fines de diagnóstico o terapéuticos, y empleando todo tipo de marcas, si bien las de carácter lumínico o enzimático son las más frecuentes.

El aprovechamiento de las propiedades magnéticas de las MBs supuso una notable ganancia en la rapidez, operatividad y eficacia de los lavados. Así, la técnica ha desarrollado numerosos sistemas de flujo continuo y equipos de lavado automatizados con el objeto de disminuir al máximo el tiempo invertido y el grado de participación del usuario, aunque a cambio de elevados costes de adquisición y/o mantenimiento (G. Wu, Assay Development: Fundamentals and Practices, John Wiley & Sons Inc., New Jersey, USA, 2010). No se consiguió su total supresión hasta fechas recientes.

Entre el grupo de técnicas sin lavado que emplean MBs están la "xMAP" o "Luminex Multianalyte Profiling" (Luminex Co., TX, USA; RT. Carson, D.A.A. Vignali, J. Immunol. Methods., 1999, 227, 41-52), la "FRET" o "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (Life Technologies Ltd., UK; BioTek, VT, USA; Innova Biosciences Ltd., UK; S. Mizukami, S. Watanabe, Y. Akimoto, K. Kikuchi, 2012, J. Am., Chem., Soc., 134, 1623- 1629), y finalmente la "Nanoplex Direct" de reciente aparición (Oxonica, CA, USA; Becton Dickinson & Co., NJ, USA).

Todas estas tecnologías de "no lavado" existentes en la técnica, utilicen o no el magnetismo, se basan en un sistema de detección de tipo óptico. Son sistemas de fluorescencia, espectrofotometría o de quimioluminiscencia. Ello supone un coste significativo no sólo en cuanto al equipo de medición, sino también en los propios reactivos marcados con moléculas luminiscentes, espectro-activas o fluorescentes, e incluso en el material accesorio, ya que muchos de los plásticos de uso frecuente en laboratorio son autofluorescentes. Además, toda tecnología basada en la emisión de luminiscencia y fluorescencia presenta una serie de inconvenientes metodológicos que se acentúan cuando se suprimen los lavados. El más común de ellos es su elevada susceptibilidad a múltiples condiciones ambientales, que puede reducir o aumentar la señal inespecíficamente ocasionando falsos resultados tanto positivos como negativos. También son numerosos los interferentes físico-químico-biológicos de la matriz de una muestra que pueden influir en la dispersión de la luz y/o emitir un cierto grado de luminiscencia de forma basal, y existen ciertas limitaciones en la muestra en cuanto al tamaño del analito y/o su complejidad por su influencia en la orientación y reactividad de las moléculas luminiscentes empleadas como "marca". Incluso el propio analista es un factor relevante en la consecución exitosa, reproducible y fiable de este tipo de técnicas lumínicas, siendo significativo en el resultado final su experiencia y destreza.

El problema que plantea la técnica por tanto es encontrar un sistema de análisis sin lavados que evite los inconvenientes de la detección óptica. La solución que aporta la presente invención es un procedimiento magneto-electroquímico que comprende la medición de la capa sólida de un producto redox sobre la superficie de un electrodo... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección magneto-electroquímica sin lavados de un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

a) incubación de dicha muestra en presencia de partículas magnéticas y de un elemento de reconocimiento ligado a un enzima, en que dicho elemento de reconocimiento y dichas partículas magnéticas son capaces de interaccionar independientemente con dicho analito,

b) aplicación de un electrodo al resultado de la etapa a) en presencia de un imán,

c) adición de un sustrato electroquímico de dicho enzima para obtener un compuesto con capacidad óxido-reductora,

d) medición electroquímica sobre la superficie del electrodo de dicho compuesto con capacidad óxido-reductora, o de al menos un producto de una reacción redox generada por dicho compuesto, en presencia de los componentes de la muestra y de los reactivos añadidos en las etapas a) y c) sin realizar etapas previas de lavado, y

e) determinación de la presencia del analito evaluando el resultado de la etapa anterior respecto de una referencia.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha muestra es una muestra biológica.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma.

4. Un procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha muestra biológica es un cultivo o enriquecimiento bacteriano.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha incubación de la etapa a) comprende una incubación previa de la muestra con dichas partículas magnéticas.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha incubación de la etapa a) comprende una incubación previa de la muestra con dicho elemento de reconocimiento ligado a un enzima.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicho elemento de reconocimiento ligado a un enzima de la etapa a) se obtiene durante la incubación con la muestra de dicho elemento de reconocimiento y dicho enzima.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que dicho elemento de reconocimiento está ligado al enzima por una molécula portadora de dicho enzima.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que dicho enzima es la fosfatasa alcalina.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicha interacción de la etapa a) entre el elemento de reconocimiento y el analito comprende al menos un segundo elemento de reconocimiento.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que dicho analito está ligado a un elemento de reconocimiento.

12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que dichas partículas magnéticas presentan adheridos activadores de interacción.

13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que dichas partículas magnéticas están ligadas a un elemento de reconocimiento.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que dichas partículas magnéticas están ligadas a dicho elemento de reconocimiento por grupos tosilo.

15. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dichas partículas magnéticas presentan un tamaño de entre 2,5 y 3 pm.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por que dicho tamaño es de 2,8 pm.

17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por que dicho elemento de reconocimiento está seleccionado entre el grupo compuesto por un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, un enzima, un péptido, un polímero, un principio activo y un microorganismo o una parte del mismo.

18. Un procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por que dicho enzima es el enzima de un fago.

19. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado por que dicho electrodo de la etapa b) está situado encima del imán.

20. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado por que dicho electrodo de la etapa b) está en posición esencialmente vertical.

21. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado por que dicho electrodo de la etapa b) contiene el imán.

22. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado por que dicho electrodo es un electrodo serigrafiado.

23. Un procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado por que dicho electrodo serigrafiado es un electrodo serigrafiado de carbono.

24. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende una etapa de absorción previa a la adición del sustrato electroquímico según la etapa c).

25. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado por que dicho sustrato electroquímico de la etapa c) comprende un compuesto indoxílico y una fuente de plata iónica.

26. Un procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado por que dicho compuesto indoxílico es 3-indoxil fosfato.

27. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 25 ó 26, en que dicha fuente de plata iónica es nitrato de plata.

28. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado por que dicha medición de la etapa d) se realiza en un tiempo máximo de 5 minutos después de la adición del sustrato electroquímico según la etapa c).

29. Un procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado por que dicho tiempo máximo de medición es de 2 min.

30. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado por que dicha medición de la etapa d) se realiza por voltamperometría cíclica o voltampería de onda cuadrada.

31. Kit analítico que contiene los agentes reactivos y dispositivos necesarios para la

detección electroquímica de un analito en una muestra, cuyas instrucciones de uso

especifican que dicha detección electroquímica se realiza sin etapas de lavado.

32. Kit analítico sin lavados para la detacción de un analito en una muestra, que contiene los reactivos y dispositivos necesarios para llevar a cabo el procedimiento según la reivindicación 1.

33. Kit analítico sin lavados para la detección de un analito en una muestra,

caracterizado por que incluye un elemento de soporte y unos agentes reactivos, en que dichos agentes reactivos están dispuestos en al menos dos formulaciones que comprenden entre dichas dos formulaciones un elemento de reconocimiento ligado a un enzima o a una molécula portadora de un enzima, partículas magnéticas y un sustrato 15 electroquímico, dicho elemento de soporte comprende un electrodo y un imán, y cuyas

instrucciones de uso indican que dicha detección se puede realizar sin necesidad de ninguna etapa de lavado.

34. Un kit según la reivindicación 33, caracterizado por que dicho electrodo es un electrodo serigrafiado de carbono.

35. Un kit según la reivindicación 33, caracterizado por que dicho electrodo es un

electrodo serigrafiado de oro.

36. Un kit según la reivindicación 33, caracterizado por que dicho electrodo es un electrodo serigrafiado de platino.