Terapia celular: un método y una composición para tratar diabetes.

Método para obtener células beta de los islotes a partir de páncreas de conejos,

comprendiendo el método:

cosechar dichos páncreas de conejos neonatos y colocar los páncreas en una disolución salina que comprende un antibiótico a una temperatura de 4-10º C;

eliminar los vasos y conductos excretores de los páncreas cosechados;

obtener microfragmentos pancreáticos picados a partir de dichos páncreas;

e incubar dichos microfragmentos pancreáticos picados en un medio libre de suero a una primera temperatura de incubación 36, 6º C a 37º C durante 6 a 10 días a 0% a 5% de CO2 durante un primer período de incubación, y periódicamente sustituir el medio libre de suero y eliminar las células indeseadas destruidas espontáneamente que comprenden células exocrinas y células de la sangre y elementos de tejido conjuntivo hasta que al menos 80% de las células que quedan son células beta de los islotes; e incubar dichos fragmentos pancreáticos picados en dicho medio libre de suero a una segunda temperatura de incubación 22º C a 29º C durante 4 a 5 días durante un segundo período de incubación hasta que al menos 2.

Terapia celular: un método y una composición para tratar diabetes.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de terapia celular y a una composición para el transplante de las células beta de los islotes aisladas y cultivadas a partir de páncreas de animal para promover la producción natural de insulina entre personas con diabetes.

2. Descripción de la técnica relacionada La diabetes tipo 1 afecta a más de un millón de norteamericanos. La diabetes tipo 1 es la forma más grave de la enfermedad, en la que el sistema inmunitario del organismo ataca a las células productoras de insulina requeridas para mantener la glucemia a niveles normales. Se sabe que una glucemia extremadamente baja puede dar como resultado ataques, conocimiento alterado, o inconciencia. En los casos más graves, las complicaciones no son bien controladas por la insulina.

Idealmente, la sustitución de células productoras de insulina en el páncreas puede liberar a los diabéticos de las inyecciones de insulina durante toda la vida, y curar efectivamente la enfermedad. El transplante de estas células de los "islotes" se puede hacer ahora de dos maneras, a través de un transplante completo de páncreas, o a través de un proceso menos invasivo y menos costoso de inyectar sólo las células de los islotes. Se ha demostrado que el transplante exitoso de páncreas es efectivo a la hora de mejorar significativamente la calidad de vida de las personas con diabetes, principalmente eliminando la necesidad de insulina exógena y las medidas diarias y frecuentes de la glucemia (Pancreas Transplantation for Patients with Type I Diabetes. Diabetes Care. 25 (Suplemento 1) : S111. Enero 2002) . Sin embargo, los transplantes de páncreas requieren una terapia de inmunosupresión para toda la vida, para evitar el rechazo del injerto y la recidiva potencial del proceso autoinmunitario, que puede destruir las células de los islotes pancreáticos.

El transplante de las células beta de los islotes a partir de páncreas de donantes ha demostrado que promueve la producción natural de insulina entre pacientes con diabetes tipo 1 y tipo 2 (véanse Sperling, M.A. Type 1 Diabetes: Etiology and Treatment. Totowa, NJ: Humana Press Inc. 2003. p. 529-552; Insulin Therapy. En: Edelman, S.V. y Henr y , R.R. Diagnosis and Management of Type 2 Diabetes. Caddo, OK: Professional Communications, Inc. 2002.

p. 121-148) . El transplante de células de los islotes se puede llevar a cabo como un procedimiento percutáneo mínimamente invasivo, en el que las células de los islotes se infunden en el hígado vía la vena porta. Sin embargo, como otros pacientes de transplantes, los receptores de islotes deben tomar fármacos inmunosupresores para evitar el rechazo de las células extrañas.

Se han estudiado los xenoinjertos o xenotransplantes de células de los islotes derivadas de cerdo o de vacuno, y han demostrado que requieren inmunosupresión.

Se ha demostrado la capacidad de las células beta precultivadas de páncreas de conejos neonatos para sobrevivir y 45 funcionar activamente en el organismo de un receptor xenogénico en experimentos en ratas con diabetes mellitus inducida experimentalmente. (Skaletsky N.N. y otros. 1994 {4}) .Se observó un efecto antidiabético expreso y a largo plazo (duración del experimento - 8 semanas) del transplante de cultivos de células de los islotes en los casos de la administración en la cavidad abdominal y en el bazo, y también en los casos de la administración en el músculo abdominal transverso. Después de los experimentos, se llevaron a cabo ensayos histológicos que descubrieron en el 50 lugar de introducción de los xenotransplantes células de los islotes con estructura conservada y sin signos de reacción inmunitaria celular. Al mismo tiempo, se detectaron claros signos de regeneración de las propias células beta en los páncreas de los animales receptores. Además de un efecto bien definido reductor del azúcar, durante los experimentos se observó un efecto profiláctico médico bien definido del xenotransplante de cultivos de células de los islotes en la complicación tardía distintiva de la diabetes - la nefropatía - (Skaletskaya G.N. y otros (2005 {4}) .

55 El documento RU 2135193 de Skaletsky et al. describe la obtención de células beta de los islotes a partir de páncreas de conejo neonato, y a métodos de transplante. Las células beta se obtienen mediante migración de fragmentos pancreáticos en un método de cultivo que requiere la adición de suero a un medio de cultivo. Rush et al. (2004 {18}) describen la conservación de islotes pancreáticos humanos en medio libre de suero durante hasta 6

60 meses. Los islotes beta obtenidos mediante dicho método fueron funcionales en ratones inmunodeprimidos.

De este modo, a pesar de los desarrollos actuales, se necesitan células de los islotes procedentes de diferentes fuentes que no requieran inmunosupresión.

65 Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia en sus totalidades.

Breve sumario de la invención En consecuencia, un aspecto de la invención comprende un método para obtener células beta de los islotes a partir de páncreas de conejos, comprendiendo el método: (a) cosechar dichos páncreas de conejos neonatos y colocar los páncreas en una disolución salina que comprende un antibiótico, a una temperatura de 4-10º C; (b) obtener microfragmentos pancreáticos picados a partir de dichos páncreas; y (c) incubar dichos microfragmentos pancreáticos picados en un medio libre de suero a una primera temperatura de incubación de 36, 6º C a 37º C durante 6 a 10 días a 0% a 5% de CO2 durante un primer período de incubación, y reponer periódicamente el medio libre de suero y eliminar células indeseadas destruidas espontáneamente que comprenden células exocrinas y células sanguíneas y elementos de tejido conjuntivo hasta que al menos 80% de las células que quedan sean células beta de los islotes; (d) e incubar dichos microfragmentos pancreáticos picados en dicho medio libre de suero a una segunda temperatura de incubación de 22º C a 29º C durante 4 a 5 días durante un segundo período de incubación hasta que al menos 78-90% de las células que quedan sean células beta de los islotes, en el que dicho medio libre de suero se repone opcionalmente de forma periódica, y de ese modo obtener células beta de los islotes.

Otro aspecto de la invención comprende una composición que comprende células beta de los islotes obtenidas de páncreas de conejos, en la que las células beta de los islotes se aíslan siguiendo un régimen seleccionado de temperatura de incubación de microfragmentos pancreáticos picados obtenidos de dichos páncreas de conejos cultivados en medio libre de suero según el método descrito anteriormente de la invención, y en la que las células beta de los islotes aisladas se obtienen en una cantidad de recuento celular de 1.500.000 ± 100.000 y tienen una viabilidad de al menos 80%, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en esta invención puede incluir cualquier sustancia adecuada, tal como líquidos, geles y sólidos que se pueden combinar con la composición y son reconocidos por su seguridad en la administración a un mamífero.

En ciertas formas de realización, la composición comprende al menos 50% de células beta de los islotes.

En ciertas formas de realización, la composición comprende al menos 78% de células beta de los islotes.

Otro aspecto de la invención comprende un uso de la composición como se describe anteriormente para promover la producción natural de insulina, comprendiendo el método: preparar la composición según la reivindicación 6 que comprende las células beta de los islotes aisladas y cultivadas a partir de páncreas de conejo; y administrar la composición según la reivindicación 6 a un sujeto que necesite insulina y por lo tanto promover la producción natural de insulina.

Descripción detallada de la invención El método de cultivo de la invención incluye el uso de un régimen seleccionado de temperatura de incubación para microfragmentos pancreáticos picados obtenidos de un conejo y cultivados en un medio libre de suero. Siguiendo el método de la invención, se obtiene una preparación pura de células beta de los islotes viables y activas, que se pueden transplantar con éxito a un paciente diabético sin el uso de ninguna supresión inmunitaria.

El método... [Seguir leyendo]

1. Método para obtener células beta de los islotes a partir de páncreas de conejos, comprendiendo el método:

cosechar dichos páncreas de conejos neonatos y colocar los páncreas en una disolución salina que comprende un antibiótico a una temperatura de 4-10º C;

eliminar los vasos y conductos excretores de los páncreas cosechados;

obtener microfragmentos pancreáticos picados a partir de dichos páncreas; e incubar dichos microfragmentos pancreáticos picados en un medio libre de suero a una primera temperatura de incubación 36, 6º C a 37º C durante 6 a 10 días a 0% a 5% de CO2 durante un primer período de incubación, y periódicamente sustituir el medio libre de suero y eliminar las células indeseadas destruidas espontáneamente que comprenden células exocrinas y células de la sangre y elementos de tejido conjuntivo hasta que al menos 80% de las células que quedan son células beta de los islotes; e incubar dichos fragmentos pancreáticos picados en dicho medio libre de suero a una segunda temperatura de incubación 22º C a 29º C durante 4 a 5 días durante un segundo período de incubación hasta que al menos 2.

7. 90% de las células que quedan son células beta de los islotes, en el que dicho medio libre de suero se sustituye opcionalmente de forma periódica, obteniendo de ese modo células beta de los islotes.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la segunda temperatura de incubación es 24º C.

3. Composición que comprende células beta de los islotes obtenidas de páncreas de conejos mediante el método según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que la composición comprende al menos 50% de células beta de los islotes. 30

5. Composición según la reivindicación 3, en la que la composición comprende al menos 78% de células beta de los islotes.

6. Composición según la reivindicación 3, para el tratamiento de diabetes para promover la producción natural de 35 insulina.

7. Composición según la reivindicación 6, para inyección intramuscular.

8. Composición según la reivindicación 7, para inyección intramuscular en el músculo abdominal recto. 40

9. Composición según la reivindicación 6, para uso sin ninguna supresión inmunitaria.