SUSTRATO PARA LA DETERMINACIÓN DE TAFI(A).

TAFI (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, en castellano, inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina) es una proenzima de 55 kDa, similar a la carboxipeptidasa B, que es activada por proteólisis en Arg-92 para dar la enzima TAFIa (35 kDa). A diferencia de la carboxipeptidasa B, que es activada como proenzima de 46 kDa por proteólisis en Arg-95 y actúa en el estómago y el tracto intestino, TAFIa es una enzima del hígado, que despliega su actividad en la sangre. El TAFIa se forma por trombina y probablemente también plasmina a partir de TAFI y es un inhibidor importante de la fibrinólisis. La activación de TAFI se refuerza en aproximadamente 1250 veces por unión de trombina a trombomodulina. El efecto inhibidor de TAFIa radica en su capacidad de escisión de las argininas y lisinas carboxiterminales, siendo su especificidad mayor frente a la arginina. El mismo TAFIa es muy sensible a las proteólisis y se vuelve inestable ya a los 37ºC. La fibrinólisis comienza cuando el plasminógeno es convertido por tPA en plasmina. A continuación, la plasmina degrada el coágulo de fibrina para formar productos de fibrina solubles, que por su parte contribuyen a una estimulación adicional de la formación de plasmina. TAFIa escinde las lisinas carboxi-terminales de dichos productos de fibrina, lo cual impide la formación del complejo de tPA/plasminógeno/fibrina, inhibiendo la fibrinólisis. La medición de la concentración de TAFIa en el plasma proporciona un importante indicio acerca del riesgo de sangrado o trombosis de los pacientes. Las carboxipeptidasas pueden analizarse a través de ensayos inmunológicos, tales como por ejemplo ELISA, que, sin embargo, no detectan la actividad de TAFI. Se han descrito ensayos funcionales en los que se hace reaccionar TAFIa con sustratos sintéticos del tipo R-Arg-COOH o R-Lys-COOH, liberando `R (por ejemplo hipurilo), que puede medirse por medio de HPLC o espectrofotometría en la región ultravioleta próxima. Hasta la actualidad, existe sólo un ensayo por procedimiento cromogénico para la medición de TAFI y TAFIa en el plasma en placas microtítulo. Sin embargo, la formación de colorantes es demasiado compleja (de varias etapas) y se desarrolla de forma insatisfactoria. Puesto que la medición de la absorción se realiza a 490 nm, no es apto - igual que también los procedimientos descritos anteriormente - para la medición en aparatos convencionales, en los que los cambios de extinción tienen lugar a 405 nm. Los derivados de tiaarginina de las siguientes fórmulas A y B se han descrito como sustratos para la carboxipeptidasa B (Bull. Korean Chem. Soc. 1998, 19(2), 189-193). Dichos compuestos presentan tasas de escisión notables frente a la carboxipeptidasa B (CPB), mientras que por otro lado son escindidos apenas por TAFIa. La detección de CPB por medio del compuesto A se realiza según el siguiente esquema 1. 2 E02781041 03-01-2012   Sorprendentemente, dicha selectividad ya puede revertirse a favor de TAFIa por medio de variaciones de estructura pequeñas. La presente invención se refiere a la utilización de sustratos para TAFIa de la fórmula general I en la que R1 es un grupo CH2NH2 o NHC(NH)NH2, AA2 son cada uno lisina, ornitina, arginina o histidina sustituida o no sustituida, en las que los sustituyentes son grupos protectores convencionales, AA3 es un aminoácido natural en el que cualquier grupo protegible y presente en la cadena lateral puede estar sustituido por un grupo protector convencional, n es 0 ó 1, y R2 es un grupo Bz, Bzl, Ac, Boc, Z, Suc, MeOSuc o Tos, a condición de que no simultáneamente n sea 0 y R1 sea NHC(NH)NH2, R2 sea Z y (AA2) sea lisina sustituida por Boc o no sustituida, como racematos o isómeros en forma de los enantiómeros puros, y sus sales con ácidos inorgánicos u orgánicos. Preferentemente, R1 es NHC(NH)NH2. 3 E02781041 03-01-2012   Entre los ejemplos de posibles significados para AA2, se incluyen Lys(-Z), Lys(-Boc), Lys(-Ac), Lys(-Bz), Lys(- Bzl), Lys(-Tos), Orn(-Z), Orn(-Boc), Orn(-2-cloro-Z), Orn(-Dnp), Orn(-Z), Orn(-Aloc), Arg(-Pbf), Arg(,- Boc)2, Arg(,-Z)2, Arg(-Tos), His(N im -Boc), His(N im -Ac), His(N im -Bz), His(N im -Bzl) o His(N im -Tos), de los cuales se prefiere en particular Lys(-Z). Entre los ejemplos de los grupos protectores aptos en el aminoácido AA3, se incluyen tBu, Bzl o Ac, prefiriéndose en particular los aminoácidos fenilalanina, alanina, serina y valina. Preferentemente, R2 es Bz o Boc. Entre los ejemplos de sales aptas, se incluyen los hidrobromuros, hidrocloruros, trifluoroacetatos o acetatos, prefiriéndose las sales de acetato, trifluoroacetato y hidrocloruro. Las abreviaturas utilizadas anteriormente para los grupos protectores, así como una serie de otras abreviaturas se explicarán en una tabla incorporada entre los Ejemplos 2 y 3. La invención se refiere también a los siguientes compuestos de la fórmula I definida en la reivindicación 1, en la que R1 es NHC(NH)NH2 o CH2NH2, AA2 es Lys(-Z) o Lys(-Boc), AA3 es Ala, Ser, Phe, Val, Ser (Bzl) o Ser (Ac), n es 0 ó 1, R2 es Bz, Boc o Z. Los compuestos de la fórmula general I, que, con relación al átomo de carbono asimétrico provisto de un sustituyente que contiene azufre, pueden estar presentes como racematos o en una de sus formas de enantiómeros puros D y L, pueden prepararse según los procedimientos conocidos de por sí, que se describirán a continuación. Los aminoácidos protegidos o derivados de oligopéptidos protegidos se convierten en las amidas de ácidos correspondientes, que a continuación se condensan a reflujo con un glioxilato de alquilo, ventajosamente de C1-6alquilo, tal como glioxilato de etilo, según el procedimiento descrito por Hong, N.J. et al., Bull. Korean Chem. Soc. 1998, 19(2), 189-193. Los derivados de hidroxiglicina resultantes se acetilan en O y se sustituyen por reacción con el compuesto de mercaptoalquilo correspondiente, tales como cisteamina, 3-mercaptopropilamina o bromuro de S-2- aminoetilisotiouronio. Los ésteres de alquilo obtenidos de los compuestos de la fórmula I se saponifican a continuación en condiciones alcalinas para dar los ácidos libres correspondientes. Los ácidos en forma de sus enantiómeros puros pueden obtenerse por medio de una hidrólisis enantioselectiva de los ésteres con la ayuda de enzimas aptas. Los compuestos de la fórmula I y sus sales de adición con ácidos son aptos para el análisis de TAFIa. Dicho análisis puede llevarse a cabo según la invención haciendo reaccionar TAFIa con un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 7 en presencia del ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico), conocido bajo el nombre de reactivo de Ellman, y determinando la absorción producida por la formación de 3-carboxi-4-nitrotiofenol entre 400 y 412 nm en función del tiempo por fotoespectrometría. La reacción mencionada se realiza a una temperatura comprendida ventajosamente entre 10ºC y 37ºC, preferentemente a temperatura ambiente, y el tiempo de reacción puede estar comprendido entre aproximadamente 5 y 15 minutos, siendo preferentemente de aproximadamente 10 minutos. La fuente utilizada para TAFIa puede ser el TAFI presente en el plasma sanguíneo. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención con mayor detalle sin limitar su alcance. La identificación y caracterización de los eluados y productos obtenidos según los Ejemplos 1 y 2 se llevaron a cabo por medio de RMN de protones, HPLC/MS por electrospray y/o análisis elemental. Ejemplo 1 Preparación de la sal de hidrocloruro de benzoil-(L)-lisil-(-benciloxicarbonil)--(D,L)-(2-guanidinoetiltio)glicina [Bz- (L)-Lys(Z)-(D,L)-Gly (-GUS)-OH·HCl] 1A) Éster etílico de benzoil-(L)-lisil-(-benciloxicarbonil)--(D,L)-hidroxiglicina [Bz-(L)-Lys(Z)-(D,L)-Gly(-OH-OEt] Se calentaron 5,0 g (13 mmol) benzoil-(L)-lisinamida y una solución de tolueno al 50% de 13,3 g (65 mmol) de glioxilato de etilo en 100 ml de THF a reflujo. Después de 4 h, la solución se enfrió a TA y se trasladó directamente a la etapa de reacción 1B). 1B) Éster etílico de benzoil-(L)-lisil-(-benciloxicarbonil)--(D,L)-acetoxiglicina [Bz-(L)-Lys(Z)-(D,L)-Gly (-OAc)-OEt] A la solución de reacción de 1A), se adicionaron 127 mg (1 mmol) de DMAP, 24,7 ml (0,31 mol) de piridina y 40 g (0,39 mol) de anhídrido acético, y la solución resultante se agitó a TA durante 90 min. La solución de reacción se filtró, pasándola por gel de sílice, el disolvente se eliminó por destilación y el producto crudo obtenido se secó en un armario de secado al vacío. Rendimiento: 14 g. 4 E02781041 03-01-2012   1C) Éster etílico de benzoil-(L)-lisil-(-benciloxicarbonil)--(D,L)-(2-guanidinoetiltio)glicina [Bz-(L)-Lys(Z)-(D,L)-Gly(- GUS)-OEt] Se disolvieron 5,5 g (19,5 mmol) de hidrobromuro del bromuro de S-(2-aminoetil)isotiouronio y 4 g (39 mmol) de TEA en 50 ml de DMF y la solución resultante se agito a TA durante 5 min. A continuación,... [Seguir leyendo]

AA2 son respectivamente lisina, ornitina, arginina o histidina sustituida o no sustituida, en las que los sustituyentes son grupos protectores convencionales, AA3 es un aminoácido natural, en el que cualquier grupo protegible presente en la cadena lateral puede estar sustituido por un grupo protector convencional, n es 0 ó 1, y R2 es un grupo Bz, Bzl, Ac, Boc, Z, Suc, MeOSuc o Tos, a condición de que no simultáneamente n sea 0, R2 sea Z y (AA2) sea lisina sustituida por Boc, como racematos o isómeros en forma de enantiómeros puros, y de sus sales con ácidos inorgánicos u orgánicos como sustratos para la determinación de TAFIa. 2. Utilización según la reivindicación 1, en la que AA2 es Lys(-Z), Lys(-Boc), Lys(-Ac), Lys(-Bz), Lys(-Bzl), Lys(-Tos), Orn(-Z), Orn(-Boc), Orn(-2-cloro-Z), Orn(-Dnp), Orn(-Z), Orn(-Aloc), Arg(-Pbf), Arg(,-Boc)2, Arg(,-Z)2, Arg(-Tos), His(N im -Boc), His(N im -Ac), His(N im -Bz), His(N im -Bzl) o His(N im -Tos), de los cuales se prefiere en particular Lys(-Z). 3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que AA3 es Ala, Ser, Phe, Val, Ile, Leu, Thr, Pro, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys, Met, Trp, Tyr o Gly, en la que cualquier grupo protegible presente en la cadena lateral puede estar sustituido por un grupo protector convencional, tal como tBu, Bzl o Ac. 4. Utilización según la reivindicación 3, en la que AA3 es Phe, Ala, Val o Ser protegido por tBu, Bzl o Ac o no protegido. 5. Utilización según la reivindicación 1, en la que R1 es NHC(NH)NH2, AA2 es Lys(-Z) o Lys(-Boc), AA3 es Ala, Ser, Phe, Val, Ser(tBu), Ser(Bzl) ó Ser(Ac), n es 0 ó 1 y R2 es Bz, Boc o Z. 6. Utilización según la reivindicación 1, en la que R1 es CH2NH2, AA2 es Lys(-Z) o Lys(-Boc), AA3 es Ala, Ser, Phe, Val, Ser(tBu), Ser(Bzl) o Ser(Ac), n es 0 ó 1 y R2 es Bz, Boc o Z. 7. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque los compuestos están presentes como sales de adición con un ácido en forma de hidrobromuros, hidrocloruros, trifluoroacetatos o acetatos. 8. Compuestos de la fórmula I definida en la reivindicación 1, en la que R1 es NHC(NH)NH2, AA2 es Lys(-Z) o Lys(-Boc), 8 E02781041 03-01-2012   AA3 es Ala, Ser, Phe, Val, Ser(tBu) o Ser(Ac), n es 0 ó 1 y R2 es Bz, Boc o Z. 9. Compuestos de la fórmula I definida en la reivindicación 1, en la que R1 es CH2NH2, AA2 es Lys(-Z) o Lys(-Boc), AA3 es Ala, Ser, Phe, Val, Ser(tBu), Ser(Bzl) o Ser(Ac), n es 0 ó 1 y R2 es Bz, Boc o Z. 10. Compuesto según la reivindicación 8, en el que AA2 es Lys(-Z), n es 0 y R2 es Bz. 11. Compuestos según una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizados porque están presentes como sales de adición con un ácido en forma de hidrobromuros, hidrocloruros, trifluoroacetatos o acetatos. 12. Utilización de los compuestos según una de las reivindicaciones 8 a 11 como sustratos para la determinación de TAFIa. 13. Procedimiento para el análisis de TAFIa, caracterizado porque TAFIa se hace reaccionar en presencia de ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) con un compuesto de la fórmula I definida en la reivindicación 1 o según una de las reivindicaciones 8 a 11 y se determina la absorción producida por la formación de 3-carboxi-4-nitrotiofenol entre 400 y 412 nm en función del tiempo por fotoespectroscopia. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 10ºC y 37ºC, en particular a temperatura ambiente, de 5 a 15 minutos, en particular durante 10 minutos. 15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la fuente utilizada para TAFIa es el TAFI presente en el plasma sanguíneo. 16. Procedimiento según la reivindicación 15 para la determinación de TAFI en el plasma sanguíneo, caracterizado porque dicho TAFI se activa por medio de trombomodulina y la trombina unida a la misma para dar TAFIa, se elimina la actividad de trombina excedente por adición de NAPAP, el TAFIa resultante se hace reaccionar en presencia de ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) con un compuesto de la fórmula I definida en la reivindicación 1 o según una de las reivindicaciones 8 a 11 y se determina la absorción producida por la formación de 3-carboxi-4-nitrotiofenol entre 400 y 412 nm en función del tiempo por fotoespectroscopia. 17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad de TAFI corresponde a 20 partes en volumen de una solución madre de 360 µg/ml, la cantidad de trombomodulina corresponde a 20 partes en volumen de una solución de 30 µg/ml, la cantidad de trombina corresponde a 20 partes en volumen de una solución de 2,7 U/ml, la cantidad de NAPAP corresponde a 20 partes en volumen de una solución de 100 µM/ml, la cantidad de ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) corresponde a 10 partes en volumen de una solución de 5 mM/ml y la cantidad del compuesto de la fórmula I definida en la reivindicación 1 o según una de las reivindicaciones 8 a 11 corresponde a 20 partes en volumen de una solución de 10 mM/ml. 18. Procedimiento para la preparación de los compuestos según una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque se somete un éster alquílico correspondiente a una saponificación alcalina. 9 E02781041 03-01-2012