SUPERFICIE BIOACTIVA CAPAZ DE MODIFICAR GENÉTICAMENTE CÉLULAS O TEJIDOS BIOLÓGICOS Y SU USO.
Superficie bioactiva capaz de modificar genéticamente células o tejidos biológicos y su uso.
Superficie bioactiva que comprende: una matriz polimérica, un complejo conector que comprende al menos un compuesto unido covalentemente a la superficie de la matriz polimérica, y un vector de transferencia génica unido al complejo conector, donde el compuesto del complejo se une covalentemente al vector de transferencia mediante un grupo seleccionado entre carboxilo, amino, isocianato e hidroxilo, y al uso de dicha superficie bioactiva para transferir un ácido nucleico a una célula. La presente invención también se refiere a un dispositivo implantable caracterizado porque presenta al menos una parte de su superficie recubierta con dicha superficie bioactiva, al uso de dicho dispositivo para transferir un ácido nucleico a una célula, a un método para transferir un ácido nucleico a una célula y a un kit para llevar a cabo dicho método.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200931268.
Solicitante: FUNDACION CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES CARLOS III (CNIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: BERNAD MIANA, ANTONIO, BORROS GOMEZ,SALVADOR, HORNA TOMAS,DAVID, GONZALEZ DE LA PE;A,MANUEL ANGEL, RAMIREZ MARTINEZ,JUAN CARLOS, CIFUENTES,ANNA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K47/34 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores o aditivos inertes; Agentes de direccionamiento o agentes modificadores enlazados químicamente al ingrediente activo. › Compuestos macromoleculares obtenidos por reacciones distintas a aquellas en las que intervienen solamente enlaces insaturados carbono-carbono, p. ej. poliésteres, poly(amino ácidos), polisiloxanos, polifosfacinas, copolímeros de polialquilenglicol o poloxámeros (A61K 47/10 tiene prioridad).
- C08G18/04 QUIMICA; METALURGIA. › C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES. › C08G COMPUESTOS MACROMOLECULARES OBTENIDOS POR REACCIONES DISTINTAS A AQUELLAS EN LAS QUE INTERVIENEN SOLAMENTE ENLACES INSATURADOS CARBONO - CARBONO (procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas para sintetizar un compuesto dado o una composición dada o para la separación de isómeros ópticos a partir de una mezcla racémica C12P). › C08G 18/00 Productos poliméricos de isocianatos o isotiocianatos. › con compuestos de vinilo.
- C08G71/00 C08G […] › Compuestos macromoleculares obtenidos por reacciones que forman un enlace ureído o uretano, diferentes a los radicales de isocianato, en la cadena principal de la macromolécula.
- C12N15/63 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
- G01N33/52 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Utilización de compuestos o de composiciones para investigaciones colorimétricas, espectrofotométricas o fluorométricas, p. ej. utilización de cintas de papel indicador.
PDF original: ES-2362772_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Superficie bioactiva capaz de modificar genéticamente células o tejidos biológicos y su uso.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biología molecular y la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere a una superficie bioactiva que comprende: una matriz polimérica,un complejo conector que comprende al menos un compuesto unido covalentemente a la superficie de la matriz polimérica, y un vector de transferencia génica unido al complejo conector, donde el compuesto del complejo se une covalentemente al vector de transferencia mediante un grupo seleccionado entre carboxilo, amino, isocianato e hidroxilo, y al uso de dicha superficie bioactiva para transferir un ácido nucleico a una célula. La presente invención también se refiere a un dispositivo implantable caracterizado porque presenta al menos una parte de su superficie recubierta con dicha superficie bioactiva y al uso de dicho dispositivo implantable para transferir un ácido nucleico a una célula. Asimismo, la presente invención se refiere a un método para transferir un ácido nucleico a una célula y a un kit para llevar a cabo dicho método.
Estado de la técnica anterior
La transferencia génica tiene un elevado potencial terapéutico, tanto en terapia génica como en ingeniería de tejidos, siendo además de gran utilidad en investigación. El factor limitante en el desarrollo de las aplicaciones basadas en la transferencia génica es la falta de sistemas eficaces para introducir el material genético en las células. Para que la transferencia génica sea efectiva el ácido nucleico debe ser transportado hasta las células diana sin que se degrade, ser internalizado en dichas células, escapar a los sistemas de degradación intracelular, ser transportado al núcleo para su transcripción, y finalmente ser traducido a proteína. Así como el uso de vectores virales o no virales facilita la superación de muchas de las barreras intracelulares en el proceso de transferencia génica, el uso de biomateriales permite solventar los problemas asociados al transporte del material génico hasta las células diana.
La transferencia génica dependiente de substrato, también denominada transfección reversa, se basa en la inmovilización de vectores virales o no virales en una superficie que permite la adhesión celular. Esta estrategia permite disminuir la degradación del material genético e incrementar la concentración de vector efectiva, de esta manera es necesaria una cantidad menor de ácido nucleico, con la consiguiente reducción de la toxicidad celular. Por otra parte, combinando la inmovilización del vector con un patrón de superficie se obtiene una herramienta que permite regular espacialmente el proceso de transferencia génica.
La inmovilización del material genético que se quiere transferir puede ser inespecífica o específica. Algunos biomateriales permiten la adsorción de vectores de transferencia génica directamente sobre la superficie; en este caso los vectores interaccionan con dichos biomateriales mediante mecanismos no específicos tales como interacciones hidrofóbicas, interacciones electrostáticas y fuerzas de van der Waals. Alternativamente, pueden introducirse interacciones específicas mediante grupos funcionales en el vector y el polímero, tales como avidina-biotina o anticuerpo- antígeno.
Hidrogeles de colágeno y ácido hialurónico que presentan en su superficie neutravidin son capaces de unir complejos de ADN y del polímero catiónico polietilenimina biotinilada (Segura et al. Biomaterials. 2005 May; 26(13): 1575-1584). El sistema avidina-biotina también se ha empleado para la inmovilización de vectores adenovirales en soportes de quitosano (Hu et al. J Gene Med. 2008 October; 10(10): 1102-1112). De manera similar, se ha descrito la inmovilización de adenovirus en geles de colágeno tipo I modificados con avidina empleando para ello un anticuerpo biotinilado específico contra adenovirus (Levy et al. Gene Ther. 2001 May; 8(9):659-67). Asimismo, se han inmovilizado adenovirus mediante anticuerpos específicos unidos directamente a películas de poliuretano (Stachelek et al. Gene Ther. 2004 Jan; 11(1):15-24). Es importante destacar que dispositivos implantables basados en estrategias de inmovilización específica se han empleado para transferencia génica in vivo (Levy et al. Gene Ther. 2001 May; 8(9):659-67; Klugherz et al. Hum Gene Ther. 2002 Feb 10; 13(3):443-54; Abrahams et al; Stroke. 2002 May; 33(5):1376-82).
Sea cual sea la estrategia empleada para la inmovilización de vectores de transferencia génica, debe existir un equilibrio entre la inmovilización del vector y la internalización celular. El biomaterial empleado debe ser adecuado para la adhesión celular y además mantener el vector de transferencia génica unido a la superficie, pero permitiendo la internalización celular del material genético. Si la unión es demasiado débil los vectores no serán retenidos en la superficie del biomaterial para su presentación a las células; por el contrario, si la inmovilización de los vectores es demasiado fuerte, la internalización del material genético puede verse seriamente disminuida.
En conclusión, la enorme potencialidad de aplicaciones que la transferencia génica en terapia génica e ingeniería de tejidos se ve seriamente limitada por la falta de sistemas eficaces, seguros y controlados de transferencia génica. La inmovilización del material génico en biomateriales es una estrategia que permite mejorar la eficacia y la seguridad, así como el control espacio-temporal del proceso de transferencia génica, siempre y cuando exista un equilibrio óptimo entre la inmovilización del material genético y su internalización celular.
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a una superficie bioactiva, que proporciona un sistema eficaz, seguro y controlado de transferencia génica. Esta superficie bioactiva de la invención comprende:
donde el compuesto del complejo (b) se une covalentemente al vector de transferencia mediante un grupo seleccionado entre carboxilo, amino, isocianato e hidroxilo, y al uso de dicha superficie bioactiva para transferir un ácido nucleico a una célula.
La presente invención también se refiere a un dispositivo implantable caracterizado porque presenta al menos una parte de su superficie recubierta con dicha superficie bioactiva y al uso de dicho dispositivo implantable para transferir un ácido nucleico a una célula. Asimismo, la presente invención se refiere a un método para transferir un ácido nucleico a una célula y a un kit para llevar a cabo dicho método.
Los inventores emplearon matrices de poliestireno cuya superficie había sido previamente modificada mediante la unión covalente con pentafluorofenil metacrilato (PFM). El tratamiento de la superficie de las matrices con PFM demostró ser efectivo para lograr la unión a la misma de partículas infectivas que contienen grupos aminos, en particular partículas lentivirales y adenovirales. Estas placas tratadas con PFM y dichas partículas son capaces de transducir genéticamente células humanas de manera más efectiva que las mismas partículas adsorbidas de forma inespecífica a placas que no habían sido tratadas con dicha molécula.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una superficie bioactiva (de aquí en adelante, superficie bioactiva de la invención) que comprende:
donde el compuesto del complejo (b) se une covalentemente al vector de transferencia mediante un grupo seleccionado entre carboxilo, amino, isocianato e hidroxilo.
Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "superficie bioactiva" se refiere a cualquier... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Superficie bioactiva que comprende:
2. Superficie bioactiva según la reivindicación 1, donde el compuesto unido a la matriz está unido al vector de transferencia mediante un grupo carboxilo.
3. Superficie bioactiva según la reivindicación 1, donde el compuesto unido a la matriz está unido al vector de transferencia mediante un grupo amino.
4. Superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto unido a la matriz, tiene la siguiente fórmula (I):
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.1.png)
donde
R1 es un radical que existe o no y si existe se selecciona de un grupo que comprende un alquilo (C1-C6), alquenilo(C1-C6), cicloalquilo o arilo;
R2 es un grupo carboxilo (-COO-), amino (-NH-), éter (-O-) o isocianato (-CON-), o
R3 es un hidrógeno, un alquilo(C1-C6) o un alqueno(C1-C6).
5. Superficie bioactiva según la reivindicación 4, donde el compuesto de fórmula (I) es:
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.2.png)
6. Superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el complejo conector comprende además una molécula seleccionada de la lista que comprende: azúcar, péptido, lípido o cualquier combinación de los mismos y donde dicha molécula se encuentra entre el vector y el grupo carboxilo, amino, isocianato e hidroxilo del compuesto unido covalente a la matriz polimérica.
7. Superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la matriz polimérica se selecciona de la lista que comprende: poliestireno, policarbonato, poli(etilenocarbonato), polietileno, poliolefinas, poli(diol citrato), poli fumarato, poli lactidos, poli caprolactona, poli acrilamidas, poli siloxanos, poliésteres, poliamidas, copolímeros de glicolicólico/láctico, poliuretano o cualquier combinación de los mismos.
8. Superficie bioactiva según la reivindicación 7, donde la matriz polimérica es poliestireno.
9. Superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el vector de transferencia génica comprende al menos un grupo amino o carboxilo.
10. Superficie bioactiva según la reivindicación 9, donde el vector de transferencia génica comprende al menos un grupo amino.
11. Superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el vector de transferencia génica se selecciona de la lista que comprende: complejo ácido nucleico-poliamina, complejo ácido nucleico-péptido, complejo ácido nucleico-polipéptido, complejo ácido nucleico-proteína, complejo ácido nucleico-dendrímero, complejo ácido nucleico-lipído-poliamina, complejo ácido nucleico-nanopartícula inorgánica modificada, vector adenoviral, vector adenoasociado, vector retroviral, vector lentiviral, vector alfaviral, vector herpesviral, vector derivado de poxvirus o vector derivado de coronavirus.
12. Superficie bioactiva según la reivindicación 11 donde el vector de transferencia génica es un vector lentiviral.
13. Superficie bioactiva según la reivindicación 11 donde el vector de transferencia génica es un vector adenoviral.
14. Dispositivo implantable caracterizado porque presenta al menos una parte de su superficie recubierta con una superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Dispositivo implantable según la reivindicación 14 donde dicho dispositivo se selecciona de la lista que comprende: stent, prótesis ortopédica, membrana biocompatible, polímero poroso, parche, hilo de sutura, cápsula y partícula.
16. Uso de la superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o del dispositivo implantable según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 para transferir un ácido nucleico a al menos una célula que entre en contacto con dicha superficie bioactiva.
17. Uso según la reivindicación 16 donde la célula es una célula eucariota.
18. Método para transferir un ácido nucleico a una célula que comprende poner en contacto la superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o del dispositivo implantable según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 con dicha célula.
19. Método según la reivindicación 18 donde la célula es una célula eucariota.
20. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 que comprende:
21. Kit según la reivindicación 20 donde el complejo conector comprende un compuesto que se selecciona de la lista que comprende:
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.3.png)
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.4.png)
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.5.png)
22. Kit para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 que comprende:
23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde el elemento necesario para la formación del vector de transferencia génica se selecciona de la lista que comprende: poliamina, péptido, polipéptido, proteína, dendrímero, lipído-poliamina, nanopartícula inorgánica modificada y plásmido que codifica una proteína de la envuelta de un vector viral.
24. Método para elaborar la superficie bioactiva según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende poner en contacto:
una matriz polimérica que comprende un complejo conector unido covalentemente a su superficie mediante un compuesto que contiene un grupo seleccionado entre carboxilo, amino, isocianato e hidroxilo y un vector de transferencia génica.
25. Método según la reivindicación 24, donde la matriz polimérica se pone en contacto con el vector de transferencia génica a una temperatura de entre 20 y 40ºC durante un periodo de tiempo de entre 5 minutos y 24 horas.
26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, donde se centrifuga el vector de transferencia génica sobre la matriz polimérica.
27. Método según la reivindicación 25, donde se centrifuga el vector de transferencia génica sobre la matriz polimérica a una velocidad de entre 100 y 20.000 x g.
28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde se somete a la matriz polimérica a una presión negativa.
29. Método según la reivindicación 24, donde se somete a la matriz polimérica a una presión negativa de entre -10-4 y -10-1 mBar.
30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29 donde la matriz polimérica se obtiene mediante un método seleccionado de la lista que comprende: deposición química, polimerización, polimerización por plasma e iCVD.
31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 donde la matriz polimérica se obtiene:
32. Método según cualquiera de las reivindicaciones anterior donde el complejo conector comprende un compuesto que se selecciona de la lista que comprende:
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.6.png)
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.7.png)
![](/img/2012/05-reivindicaciones/superficie-bioactiva-capaz-modificar-geneticamente-celulas-o.8.png)
33. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, donde el complejo conector además comprende una molécula seleccionada de la lista que comprende azúcar, péptido, lípido o cualquier combinación de los mismos.
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