Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos.

La invención define un sensor electroquímico para detectar analitos en medios líquidos con estructura multicapa (Figura 1) que comprende, entre otras, una primera capa (1) que comprende un material carbonoso depositada sobre un sustrato, constituyendo dicha capa el sistema de electrodos del sensor electroquímico que está compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo; y una cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo seleccionada entre (d1) y (d2), donde:

(d1) comprende una capa que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y una capa que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre dicha capa de politiofeno; y

(d2) es una capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno.

Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos.

Campo de la invención La invención se refiere al campo de los sensores electroquímicos para la detección de analitos en medios líquidos. En particular, la invención se refiere a sensores electroquímicos que incluyen electrodos sensores basados en materiales conductores de bajo coste (materiales carbonosos y politiofenos) los cuales, depositados sobre un soporte adecuado con una geometría óptima permiten, mediante técnicas electroquímicas, la detección de concentraciones mínimas de compuestos en medios líquidos. Así, el sensor electroquímico de la invención combina límites de detección mínimos a la vez que bajos costes de producción.

Antecedentes de la invención El ámbito medioambiental, agroalimentario y médico-sanitario requieren herramientas de control y detección eficaces que, aplicadas a problemáticas concretas, permitan una mejora en la calidad de vida. Así, se hace cada vez más necesario en el campo del medio ambiente el control de pesticidas y tóxicos en aguas; y en el campo alimentario, el control de pesticidas o patógenos en los alimentos previamente a su introducción en el mercado, así como la detección rápida del deterioro de los alimentos. Igualmente, en el campo médico-sanitario es imprescindible identificar la presencia de organismos externos en el cuerpo humano y su concentración, así como el diagnóstico precoz de enfermedades.

Los métodos analíticos tradicionales se basan en cromatografía líquida, gaseosa o espectrometría de masas. En líneas generales, estos son métodos muy fiables, con altos grados de detección. Sin embargo, son métodos caros y excesivamente lentos. Además, se basan en la recolecta de muestras para un posterior análisis, por lo que no permiten un control en línea. Existe por ello la necesidad de disponer de herramientas analíticas que requieran una preparación de muestra mínima, que posibiliten una medida rápida, que sean portátiles y aplicables in situ, y que permitan actuar a tiempo frente a situaciones adversas.

Estas tecnologías deben cumplir dos requerimientos. En primer lugar, un alto grado de sensibilidad, siendo éste un factor limitante y, en segundo lugar, que estos grados de sensibilidad se obtengan en base a tecnologías de bajo coste, portátiles y a las que puedan acceder los múltiples usuarios.

La Unión Europea ha fijado un límite máximo de residuos pesticidas en alimentos que ronda los 0, 1 microgramos por kilogramo de alimento. Así, las exigencias de control y detección derivadas de esta normativa son enormes. Se exige el desarrollo de nuevas herramientas de control y monitorización que permitan no sólo la detección de esas trazas de compuesto, sino una tecnología de detección que pueda ser empleada en cualquier momento y lugar. Esto es, que esté al alcance de agricultores, empresas agroalimentarias, expendedores de pesticidas, laboratorios o cualquier agente interesado en controlar la presencia de pesticidas en los vegetales y frutas frescas.

En cuanto al sector médico-sanitario, se requieren tecnologías de detección de organismos externos en el cuerpo humano y su concentración para el diagnóstico precoz de enfermedades. Cuanto mayor sea el grado de sensibilidad, antes se dispondrá del diagnóstico, permitiendo así un control y tratamiento adecuado. Las tecnologías de bajo coste favorecerán, a su vez, el uso regular en la consulta del médico, o incluso un diagnóstico personal o doméstico, evitando la necesidad de análisis caros y lentos en los laboratorios hospitalarios.

Se han descrito en el estado de la técnica diferentes sensores electroquímicos basados en la deposición de varias pistas de material sobre un sustrato aislante que puede ser plástico o cerámico. Las pistas pueden ser depositadas mediante serigrafía, litografía, deposición en estado vapor, esprayado, o técnicas de deposición similares. La primera capa consiste en un material conductor metálico que define la geometría de los electrodos (electrodo o electrodos de trabajo o sensores, electrodo de referencia y contraelectrodo) . Esta primera capa de material conductor metálico suele ser típicamente de plata, si bien se han descrito otros posibles materiales metálicos tales como oro, platino, paladio, cobre o tungsteno (US 5, 120, 420, US 5, 798, 031, US 2005/0183953 A1, WO 2007/026152, US 2007/0080073) . La segunda capa consiste habitualmente en un material conductor depositado sobre el electrodo de trabajo y sobre el contraelectrodo que puede ser metálico tal como una pasta a base de oro, plata, platino, paladio, cobre o tungsteno, por ejemplo; o no-metálico tal como una pasta fabricada en base a un material de carbono (grafito o negro de humo, por ejemplo) (US 5, 120, 420, US 5, 798, 031, US 2005/0183953 A1, WO 2007/026152, US 2007/0080073) , o en base a un polímero conductor (WO 2007/026152) . En algunos casos, existe una tercera capa que suele consistir en una pasta de Ag/AgCl, depositada únicamente sobre el electrodo de referencia (US 2005/0183953 A1) . Asimismo, sobre el electrodo de trabajo se puede depositar una cuarta capa de material aislante, típicamente de material polimérico que puede ser un gel polimérico (celulosa, poli (alcohol vinílico) , gelatina, Tween-20, Tritón X-100, Surfinol, etc.) para el atrapamiento físico de un compuesto biológico participante en la detección electroquímica (US 2005/0183953 A1) . Este compuesto biológico es responsable de la especificidad y detección electroquímica y puede ser una enzima, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos o vitaminas, por ejemplo (US 2005/0183953 A1, US 5, 120, 420, US 5, 798, 031, FR 2 798 145) .

Esta última capa de material en el electrodo de trabajo puede incorporar un mediador. El mediador actúa aceptando electrones desde la enzima o donando electrones a la misma una vez que la reacción electroquímica ha ocurrido. Así, en algunos casos, el mediador puede actuar regenerando la enzima oxido-reductasa. Los mediadores descritos son complejos de metales de transición como los derivados de ferroceno o ferrocianuros (US 5, 653, 863) , pero también pueden tratarse de benzoquinonas y naftoquinonas (US 4, 746, 607) , compuestos nitrosos o hidroxilaminas (EP 0 354 441) , flavinas, fenazinas, fenotiazinas, o indofenoles (EP 0 330 517) .

No se ha descrito en el estado de la técnica la utilización de politiofenos como agentes mediadores en la fabricación de sensores electroquímicos, una familia de polímeros conductores intrínsecos de elevada estabilidad y procesables a partir de dispersiones acuosas. Las patentes US 4, 959, 430 y US 4, 987, 042 describen diferentes procedimientos de preparación de dispersiones basadas en poli (etilen-dioxi-tiofeno) y las patentes US 5, 766, 515 y US 5, 370, 981 su uso en forma de electrodo transparente en dispositivos electroluminiscentes y para preparar plásticos antiestáticos, respectivamente. Asimismo, en el documento FR 2 798 145 se describe el uso de politiofenos, entre muchos otros polímeros conductores electroquímicamente sintetizados, como soporte para el anclaje de sondas de reconocimiento específico, ya que contienen grupos funcionales en los que se enlazan dichas sondas. Por otro lado, en el documento WO 2007/026152 se describe el uso de politiofenos, entre otros polímeros conductores, como componente del electrodo sustituyendo al material de carbono en la segunda capa, pero no como mediador.

Igualmente, tampoco se han descrito sensores electroquímicos que prescindan de la primera capa de material conductor metálico, dando lugar a una tecnología de bajo coste.

Así pues, continúa existiendo en el estado de la técnica la necesidad de sensores electroquímicos alternativos de bajo coste, que no incorporen materiales costosos, y cuyo diseño posibilite la detección de analitos con una máxima sensibilidad.

El sensor electroquímico de la presente invención que usa politiofenos como mediadores y una primera capa a base de material carbonoso permite la detección de analitos en un medio líquido con un alto grado de sensibilidad y con menor coste, posibilitando el análisis de concentraciones mínimas de estos analitos en cualquier momento, en cualquier lugar y por parte de múltiples usuarios.

Objeto de la invención La presente invención, por tanto, tiene por objeto proporcionar un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para preparar dicho sensor electroquímico.

Breve descripción de las figuras...

1. Sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos caracterizado porque comprende:

(a) una primera capa (1) que comprende un material carbonoso depositada sobre un sustrato, constituyendo dicha capa el sistema de electrodos del sensor electroquímico que está compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo;

(b) una segunda capa (2) que comprende un material metálico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia;

(c) una tercera capa (3) que comprende un material aislante depositada sobre una parte del sistema de electrodos, siendo dicha parte la que queda entre la superficie de análisis (3a) y los contactos eléctricos (3b) del equipo de medida, de modo que quede expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos;

(d) una cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo seleccionada entre (d1) y (d2) , donde:

(d1) comprende una capa que comprende un politiofeno depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y una capa que comprende un gel polimérico no conductor depositada sobre dicha capa de politiofeno; y (d2) es una capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno.

2. Sensor según la reivindicación 1, caracterizado porque la cuarta capa (4) que comprende politiofeno y gel polimérico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo es la capa (d2) de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno.

3. Sensor según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una capa adicional que comprende un mediador electroquímico depositada únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y sobre la que se deposita la capa (d2) de gel polimérico conductor.

4. Sensor según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una capa intermedia que comprende un material metálico depositada sobre el sustrato y sobre la que se deposita la primera capa.

5. Sensor según una cualquiera de las reivindicaciones1a4, caracterizado porque el politiofeno contiene unidades estructurales repetitivas de fórmula (I) ,

en la que R1 yR2 son independientemente un grupo alquilo C1-C12 o forman un grupo 1, n-alquileno C1-C12, siendo n = 1-12, opcionalmente sustituidos por un grupo alquilo C1-C12, alqueno C2-C12, vinileno, bencilo, fenilo, halógeno, o por un grupo funcional éster, amino, amido o éter opcionalmente sustituido por un grupo alquilo C1-C12.

6. Sensor según la reivindicación 5, caracterizado porque en el politiofeno los grupos R1 yR2 forman un grupo alquileno seleccionado entre metileno, 1, 2-etileno y 1, 3-propileno.

7. Sensor según la reivindicación 6, caracterizado porque en el politiofeno los grupos R1 yR2 forman un grupo 1, 2-etileno.

8. Sensor según la reivindicación 5, caracterizado porque el politiofeno comprende un dopante aniónico.

9. Sensor según la reivindicación 8, caracterizado porque el dopante aniónico es un anión inorgánico seleccionado entre un anión sulfato, cloruro y bromuro; un anión orgánico con grupos sulfonato o fosfato seleccionado entre un ácido p-toluen-sulfónico y un ácido p-toluen-fosfónico; o un polianión orgánico seleccionado entre ácidos carboxílicos poliméricos, preferiblemente poli (ácido acrílico) , poli (ácido metacrílico) o poli (ácido maleico) ; ácidos sulfónicos poliméricos, preferiblemente ácido poli (estiren sulfónico) o ácido poli (vinil sulfónico) ; o copolímeros de ácidos vinilcarboxílicos y ácidos vinilsulfónicos con otros monómeros polimerizables, preferiblemente estireno y monómeros acrílicos o metacrílicos.

10. Sensor según una cualquiera de las reivindicaciones1a9, caracterizado porque el material carbonoso de la primera capa se selecciona entre grafito, negro de humo y nanotubos de carbono.

11. Sensor según la reivindicación 10, caracterizado porque el material carbonoso es grafito.

12. Sensor según una cualquiera de las reivindicaciones1a11, caracterizado porque la cuarta capa comprende además un compuesto biológico.

13. Sensor según la reivindicación 12, caracterizado porque el compuesto biológico se selecciona entre enzimas, coenzimas, anticuerpos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, glucoproteínas, lipoproteínas, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, monosacáridos, oligosacáridos y bacterias.

14. Procedimiento para la preparación de un sensor electroquímico según las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende:

(A) obtener sobre el sustrato la primera capa que comprende un material carbonoso y que constituye el sistema de electrodos compuesto al menos por un electrodo de referencia, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo;

(B) obtener la segunda capa que comprende un material metálico únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de referencia;

(C) obtener la tercera capa que comprende material aislante sobre la parte del sistema de electrodos que queda entre la superficie de análisis y los contactos eléctricos del equipo de medida de modo que deje expuesta únicamente la parte inferior de los electrodos del sistema de electrodos; y

(D) obtener la cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico únicamente sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo.

15. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico se obtiene mediante un método seleccionado entre (D1) y (D2) , donde:

(D1) comprende obtener la capa que comprende un politiofeno sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo y obtener después la capa que comprende un gel polimérico no conductor sobre la capa que comprende un politiofeno; y (D2) comprende obtener la capa de gel polimérico conductor que comprende un gel polimérico no conductor y un politiofeno sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, caracterizado porque la obtención de la cuarta capa comprende:

(i) la aplicación de disoluciones verdaderas, dispersiones coloidales o dispersiones estables de partículas finamente divididas, bien acuosas bien base disolvente, de politiofeno previamente obtenidas mediante polimerización oxidativa o polimerización enzimática; o

(ii) la aplicación de disoluciones, bien acuosas bien base disolvente, de monómeros tiofeno y posterior polimerización in situ de los mismos.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200930539

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 30.07.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

50. 511. Resumen; apartados: 2.1, 2.3 y 2.4. 1-16 A VALDES-RAMIREZ, G., et al., Acetylcholinesterase-based biosensors for quantification of carbofuran, carbar y l, methylparaoxon, and dichlorvos in 5% acetonitrile, Anal. Bioanal. Chem., 2008, Vol. 392, págs.

69. 707. Resumen; apartado: "Experimental"; fig. 1. 1-16 A ISTAMBOULIE, G., et al., Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase, Biosensors and Bioelectronics, 2007, Vol. 23, págs.

50. 512. Resumen; apartados: 2.2 y 2.6. 1-16 A GERARD, M., et al., Application of conducting polymers to biosensors, Biosensors and Bioelectronics, 2002, Vol. 17, págs.

34. 359. Resumen; apartados: 2 y 4. 1-16 A KROS, A., et al., Poly (pyrrole) versus poly (3, 4-ethylenedioxythiophene) : implications for biosensor applications, Sensors and Actuators B, 2005, Vol. 106, págs.

28. 295. Resumen. 1-16 A WO 2006009324 A1 (CANON KABUSHIKI KAISHA) 26.01.2006, resumen; ejemplo 4. 1-16 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 19.04.2011 Examinador M. García Poza Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200930539

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

C12Q1/00 (2006.01) G01N27/30 (2006.01) G01N33/487 (2006.01) G01N33/543 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C12Q, G01N

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, CAPLUS, XPESP

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930539

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 19.04.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930539

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

50. 511. D02 VALDES-RAMIREZ, G., et al., Acetylcholinesterase-based biosensors for quantification of carbofuran, carbar y l, methylparaoxon, and dichlorvos in 5% acetonitrile, Anal. Bioanal. Chem., 2008, Vol. 392, págs.

69. 707. D03 ISTAMBOULIE, G., et al., Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase, Biosensors and Bioelectronics, 2007, Vol. 23, págs.

50. 512. D04 GERARD, M., et al., Application of conducting polymers to biosensors, Biosensors and Bioelectronics, 2002, Vol. 17, págs.

34. 359. D05 KROS, A., et al., Poly (pyrrole) versus poly (3, 4ethylenedioxythiophene) : implications for biosensor applications, Sensors and Actuators B, 2005, Vol. 106, págs.

28. 295. D06 WO 2006009324 A1 (CANON KABUSHIKI KAISHA) 26.01.2006

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración El objeto de la invención es un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos.

El documento D01 divulga biosensores de acetilcolinesterasa desarrollados para resolver mezclas de dos pesticidas. Estos sensores tienen un sistema de tres electrodos: el electrodo de trabajo de carbono modificado con cobalto ftalocianina (CoPh) , el contraelectrodo de grafito y el electrodo de referencia de Ag/AgCl. Sobre el electrodo de trabajo se encuentran las enzimas inmovilizadas por un fotopolímero basado en poli (vinil alcohol) .

El documento D02 divulga biosensores de acetilcolinesterasa desarrollados para cuantificación de diferentes pesticidas. Estos sensores tienen un sistema de tres electrodos que se forman con las siguientes capas: una capa conductora de plata, una capa de carbono, una capa de Ag/AgCl sobre el electrodo de referencia, una capa de Co-Ph sobre el electrodo de trabajo y finalmente una capa aislante. Las enzimas se colocan sobre el electrodo de trabajo inmovilizadas por una matriz polimérica.

El documento D03 divulga un biosensor de acetilcolinesterasa desarrollado para detección de pesticidas. El sensor tiene un sistema de tres electrodos como en los documentos anteriores. En el electrodo de trabajo se incluye pasta de carbono con tetracianoquinodimetano (TCNQ) como mediador.

El documento D04 divulga la aplicación de polímeros conductores como biosensores, como por ejemplo el tiofeno. El interés de estos polímeros se encuentra en que pueden atrapar enzimas sobre electrodos.

El documento D05 divulga biosensores de poli (3, 4-etilenedioxitiofeno) (PEDOT) y poli (pirrol) como el componente activo. Estos biosensores están basados en membranas y se utilizan para la medición de glucosa. Este documento divulga que el PEDOT es un politiofeno con gran estabilidad electroquímica y que no es necesario utilizar un mediador.

El documento D06 divulga un electrodo de enzimas constituido por una membrana conductora porosa en la que se deposita el polímero conductor en los poros de la misma y sobre el que se fijan las enzimas. Uno de los polímeros es el PEDOT.

Ninguno de los documentos citados divulga un sensor electroquímico para la detección de analitos en medios líquidos caracterizado porque comprende: una primera capa de material carbonoso, que constituye el sistema de electrodos compuesto por 3 electrodos; una segunda capa metálica depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo; una tercera capa aislante y una cuarta capa que comprende politiofeno y gel polimérico depositada sobre el extremo inferior del electrodo de trabajo.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930539

El sensor de la invención, recogido en la reivindicación 1, se diferencia de los divulgados en los documentos D01 a D03, en dos aspectos, principalmente. En primer lugar, en el sensor de la invención, la capa que define el sistema de electrodos es una capa de carbono. En segundo lugar, el componente activo del electrodo de trabajo en los documentos D01 a D03 es CoPh o TCNQ, siendo la única función del polímero la de fijar las enzimas al electrodo. Sin embargo, en el sensor de la invención la capa polimérica está formada por un polímero conductor que actúa como componente activo y como fijador de enzimas. No sería obvio para el experto en la materia, llegar al sensor de la invención a partir del estado de la técnica mencionado.

Por lo tanto, el objeto de la invención, según se recoge en las reivindicaciones 1 a 16 es nuevo y tiene actividad inventiva (Arts. 6.1 y 8.1 LP) .

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