Resistencia a nematodos específicos de raíces de plantas.

Método de preparación de una planta transgénica resistente a nematodos,

comprendiendo el método lasetapas de:

a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz enasociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-5 elicited_111B quecomprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38;

b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante;

c) regenerar plantas transgénicas a partir de la célula vegetal transformada; y

d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran una resistencia aumentada a la infección pornematodos parásitos de plantas en comparación con plantas de tipo natural que no comprenden el vectorde expresión recombinante.

Resistencia a nematodos específicos de raíces de plantas Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense con número de serie 61/201.471, presentada el 11 de diciembre de 2008, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento como referencia.

Campo de la invención La invención se refiere a la mejora de la productividad agrícola a través del uso de semillas y plantas transgénicas resistentes a nematodos, y a métodos de preparación de tales plantas y semillas.

Antecedentes de la invención Los nematodos son gusanos redondos microscópicos que se alimentan de las raíces, las hojas y los tallos de más de 2.000 cultivos en hileras, vegetales, frutas y plantas ornamentales, provocando unas pérdidas estimadas en cultivos de 100.000 millones de $ en todo el mundo. Una variedad de especies de nematodos parásitos infecta a plantas de cultivo, incluyendo nematodos del nódulo de la raíz (NNR) , nematodos que forman quistes y nematodos que forman lesiones. Los nematodos del nódulo de la raíz, que se caracterizan por provocar la formación de agallas en las raíces en sitios de alimentación, tienen un espectro de huésped relativamente amplio y por tanto son parásitos en un gran número de especies de cultivo. Las especies de nematodos que forman quistes y de nematodos que forman lesiones tienen un espectro de huésped más limitado, pero todavía provocan pérdidas considerables en cultivos susceptibles.

Los nematodos parásitos están presentes por todos los Estados Unidos, produciéndose las mayores concentraciones en las regiones templadas, húmedas del sur y el oeste y en suelos arenosos. El nematodo del quiste de la soja (Heterodera glycines) , la plaga más grave de las plantas de soja, se descubrió por primera vez en los Estados Unidos en Carolina del Norte en 1954. Algunas zonas están tan fuertemente infestadas por el nematodo del quiste de la soja (NQS) que la producción de soja ya no es económicamente posible sin medidas de control. Aunque la soja es el principal cultivo económico atacado por NQS, NQS parasitiza unos cincuenta huéspedes en total, incluyendo cultivos de campo, vegetales, plantas ornamentales y malas hierbas.

Los signos del daño por nematodos incluyen crecimiento reducido y amarilleamiento de las hojas, y marchitamiento de las plantas durante los periodos cálidos. La infestación por nematodos, sin embargo, puede provocar pérdidas de rendimiento significativas sin ningún síntoma de enfermedad aéreo obvio. Las causas principales de la reducción del rendimiento se deben a daño en la raíz subterránea. Las raíces infectadas por NQS padecen enanismo o crecimiento reducido. La infestación por nematodos también puede disminuir el número de nódulos fijadores de nitrógeno en las raíces, y puede hacer que las raíces sean más susceptibles a ataques por otros nematodos de plantas transmitidos por el suelo.

El ciclo de vida de los nematodos tiene tres estadios principales: huevo, juvenil y adulto. El ciclo de vida varía entre especies de nematodos. El ciclo de vida de NQS es similar a los ciclos de vida de otros nematodos parásitos de plantas. El ciclo de vida de NQS puede completarse habitualmente en de 24 a 30 días en condiciones óptimas, mientras que otras especies pueden tardar tanto como un año, o más, en completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de humedad y temperatura se vuelven favorables en la primavera, los juveniles con forma de gusano eclosionan de los huevos en el suelo. Sólo los nematodos en el estadio de desarrollo juvenil pueden infectar raíces de soja.

Tras penetrar en las raíces de soja, los juveniles de NQS se mueven a través de la raíz hasta que entran en contacto con el tejido vascular, momento en el que dejan de migrar y comienzan a alimentarse. Con un estilete, el nematodo inyecta secreciones que modifican determinadas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz se transforman morfológicamente en sincitios multinucleados grandes (o células gigantes en el caso de NNR) , que se usan como fuente de nutrientes para los nematodos. Por tanto, los nematodos que se alimentan de manera activa roban nutrientes esenciales de la planta dando como resultado pérdida de rendimiento. A medida de los nematodos hembra se alimentan, se hinchan y finalmente se hacen tan grandes que sus cuerpos rompen el tejido de la raíz y quedan expuestos en la superficie de la raíz.

Tras un periodo de alimentación, los NQS macho migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan las hembras adultas agrandadas. Los machos mueren entonces, mientras que las hembras permanecen unidas al sistema radicular y siguen alimentándose. Los huevos en las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco de huevos fuera del cuerpo, y entonces posteriormente dentro de la cavidad corporal del nematodo. Finalmente, toda la cavidad corporal de la hembra adulta se llena de huevos, y el nematodo muere. Es el cuerpo de la hembra muerta lleno de huevos lo que se denomina quiste. Finalmente, los quistes se desprenden y se encuentran libres en el suelo. Las paredes del quiste se vuelven muy duras, proporcionando una excelente protección para los de aproximadamente 200 a 400 huevos contenidos dentro. Los huevos de NQS sobreviven dentro del quiste hasta que se producen las condiciones de eclosión apropiadas. Aunque muchos de los huevos pueden eclosionar en el plazo del primer año, muchos también sobrevivirán dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nematodo puede moverse a través del suelo sólo unas cuantas pulgadas al año con sus propias fuerzas. Sin embargo, la infestación por nematodos puede propagarse distancias sustanciales de una variedad de modos. Cualquier cosa que pueda moverse por suelos infestados puede propagar la infestación, incluyendo maquinaria agrícola, vehículos y herramientas, viento, agua, animales y trabajadores agrícolas. Partículas del suelo del tamaño de las semillas a menudo contaminan las semillas recogidas. En consecuencia, la infestación por nematodos puede propagarse cuando se plantan semillas contaminadas de campos infestados en campos no infestados. Incluso hay pruebas de que determinadas especies de nematodos pueden propagarse mediante aves. Sólo algunas de estas causas pueden prevenirse.

Las prácticas tradicionales para manejar la infestación por nematodos incluyen: mantener niveles apropiados de pH del suelo y nutrientes del suelo en tierra infestada por nematodos; controlar otras enfermedades de plantas, así como plagas de malas hierbas e insectos; usar prácticas de saneamiento tales como arado, plantación y cultivo de campos infestados por nematodos sólo tras trabajar en campos no infestados; limpiar el equipo meticulosamente con agua a alta presión o vapor tras trabajar en campos infestados; no usar semillas hechas crecer en tierra infestada para plantar campos no infestados a menos que la semilla se haya limpiado apropiadamente; rotar los campos infestados y alternar cultivos huésped con cultivos no huésped; usar nematicidas; y plantar variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas con el fin de conferir un aumento de resistencia a nematodos parásitos de plantas. Por ejemplo, varios enfoques implican la transformación de plantas con ARN bicatenario que puede inhibir genes de nematodos esenciales. Otros enfoques de biotecnología agrícola proponen sobreexpresar genes que codifican para proteínas que son tóxicas para nematodos. Las patentes estadounidenses n.os 5.589.622 y 5.824.876 se refieren a la identificación de genes de plantas expresados específicamente en o adyacentes al sitio de alimentación de la planta tras la unión del nematodo.

El documento US 2009/0089896 da a conocer un promotor de un gen de tipo Mtn21 que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/077892 da a conocer un promotor de un gen de tipo peroxidasa que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/071726 da a conocer un promotor de un gen de tipo trehalosa-6-fosfato fosfatasa que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/095887 da a conocer un promotor de un gen de tipo Mtn3 que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/095888 da a conocer el promotor de un gen de tipo At5g12170 que se induce en sincitios de soja infectada por NQS.

Varias publicaciones de patente dan a conocer proféticamente y reivindican genéricamente plantas transgénicas que comprenden uno cualquiera o más de miles de genes de plantas y que tienen características agronómicas mejoradas. Los ejemplos de tales publicaciones incluyen... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de una planta transgénica resistente a nematodos, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en 5 asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38;

b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante;

c) regenerar plantas transgénicas a partir de la célula vegetal transformada; y

d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran una resistencia aumentada a la infección por 10 nematodos parásitos de plantas en comparación con plantas de tipo natural que no comprenden el vector de expresión recombinante.

2. Planta transgénica resistente a nematodos que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38.

3. Semilla que es una línea pura para un transgén que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38.