Receptor de proteína de la neurotoxina botulínica A y sus utilizaciones.

Polipéptido aislado del dominio luminal (aminoácidos 454-579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens,

ligando el polipéptido aislado el fragmento Hc de la neurotoxina botulínica A.

Receptor de proteína de la neurotoxina botulínica A y sus utilizaciones.

Descripción de la invención La presente invención se relaciona con un polipéptido que liga la neurotoxina botulinum A (BoNT/A) generada por Clostridium botulinum. Este polipéptido es un polipéptido del dominio luminal (aminoácidos 454-579) de la glicoproteína 2C (SV2C) de la vesícula sináptica de homo sapiens, de manera que liga el fragmento Hc de la neurotoxina botulinum A. La invención se relaciona en particular con el uso del polipéptido y de las partes de péptidos de éste como antagonista para la reducción de la neurotoxicidad de BoNT/A, como auxiliares para la identificación de sustancias que reducen la liga de BoNT/A a células neuronales y para la detección de BoNT/A en diferentes matrices.

Las células neuronales liberan sustancias transmisoras mediante la exocitosis. Como exocitosis se hace referencia a la fusión de las membranas de vesículas intracelulares con la membrana del plasma. En este proceso se derrama simultáneamente el contenido vesicular a la hendidura sináptica. La fusión de ambas membranas es regulada mediante calcio que reacciona con la proteína sinaptotagmina. Junto con los demás cofactores la sinaptotagmina controla el estado de tres, así llamadas, proteínas de fusión, la SNAP-25, la sinaptobrevina 2 y la sintaxina 1A. Mientras que la sintaxina A1 y la sinaptobrevina 2 están integradas en la membrana del plasma y de la vesícula, el SNAP-25 está ligado sólo débilmente con la membrana del plasma. Al incrementarse la concentración de calcio intracelular, las tres proteínas ligan entre sí aproximándose las dos membranas y a continuación se fusionan. En las neuronas colinérgicas se libera acetilcolina, que causa las contracciones musculares, la secreción de sudor y otras reacciones mediadas de modo colinérgico.

Las tres proteínas de fusión precedentemente mencionadas son las moléculas objetivo (sustratos) de la cadena ligera (LC) de las neurotoxinas clostridianas, que son formadas por las bacterias C. botulinum, C. butiricum, C. baratii y C. tetani.

La bacteria anaeróbica, gram positiva C. botulinum produce siete diferentes serotipos de la neurotoxina clostridiana. Éstos se designan como las neurotoxinas Botulinum (BoNT/A a BoNT/G) . De entre éstas son sobre todo BoNT/A y BoNT/B las que causan enfermedades neuroparalíticas en el hombre y el animal, que son designadas como botulismo. Las esporas de C. botulinum están presentes en la tierra, pero pueden desarrollarse también en conservas alimenticias no correctamente esterilizadas y cerradas de producción casera, que son el origen de muchos casos de botulismo.

La BoNT/A es la más activa de todas las sustancias biológicas conocidas. Tan solo 5-6 pg de BoNT/A purificada representan una MLD (dosis letal mínima) . Una unidad (U) de BoNT/A es definida como MLD que provoca la muerte después de una inyección intraperitoneal la mitad de ratones Swiss Webster hembras con un peso de 18-20 g cada uno. Se caracterizaron siete BoNT inmunológicamente diferentes. Portan las designaciones Bo/NTA, B, C1, D, E, F y G y pueden diferenciarse mediante neutralización con anticuerpos específicos de serotipo. Los diferentes serotipos de BoNT se diferencian en las especies de animales afectados en cuanto a la gravedad y la duración de la parálisis causada. Así, BoNT/A es 500 veces más activa, por ejemplo, en la rata en cuanto a la parálisis que BoNT/B. A esto se le añade que BoNT/B en primates, en una dosificación de 480 U/kg peso corporal, no resultó tóxica. La misma cantidad de BoNT/A corresponde a 12 veces la dosis letal de esta sustancia en los primates. Por otro lado, en los ratones, la duración de la parálisis después de inyección de BoNT/A es 10 veces más larga que después de inyección de BoNT/E.

Las BoNT son usadas para el tratamiento de disfunciones neuromusculares que se caracterizan por una hiperactividad en músculos del esqueleto, causada por nervios patológicamente hiperactivos. La BoNT/A es admitida por la U.S. Food and Drug Administration para el tratamiento de blefarospasmo, estrabismo, hiperhidrosis, arrugas y espasmos hemifaciales. Comparado con BoNT/A, los demás serotipos de BoNT poseen obviamente una actividad menor y una duración de actividad más corta. Los efectos clínicos de BoNT/A administrada de manera intramuscular periférica se presentan usualmente dentro de una semana. La duración de la supresión de síntomas por una sola inyección intramuscular de BoNT/A asciende normalmente a aproximadamente tres a seis meses.

Las neurotoxinas clostridianas hidrolizan específicamente diferentes proteínas del aparato de fusión. BoNT/A, C1 y E dividen SNAP-25, mientras que BoNT/B, D, F, G, así como la neurotoxina tetánica (TeNT) atacan la proteína de membrana, asociada con la vesícula (VAMP) 2 - llamada también sinaptobrevina 2-. BoNT/C1 divide además la sintaxina 1A.

Las bacterias clostridias liberan las neurotoxinas como polipéptidos de una cadena con, respectivamente, 1251 a 1315 aminoácidos. A continuación, unas proteasas endógenas separan cada una de estas proteínas en un sitio determinado en 2 cadenas en cada caso (‘muescado') , permaneciendo ambas cadenas, sin embargo, unidas entre sí mediante un puente disulfúrico. Estas proteínas de cadena doble son designadas como holotoxinas (véase Shone et al. (1985) , Eur. J., Biochem. 151, 75-82) . Las dos cadenas tienen diferentes funciones. Mientras la parte menor

representa la cadena ligera (light chain = LC) , una endoproteasa dependiente de Zn2+, la unidad mayor (heavy chain = HC) es el transportador de la cadena ligera. Mediante tratamiento de la HC con endopeptidasas se produjeron dos fragmentos de 50 kDa (véase Gimenez et al. (1993) , J. Protein Chem. 12, 351-363) . La mitad que termina en un amino (fragmento HN) se integra a un valor pH bajo en membranas y trasloca la LC en el citosol de la célula neuronal. La mitad que termina en carboxilo (fragmento HC) liga en polisialogangliósidos complejos que sólo existen en las membranas de células neuronales, y en receptores de proteínas identificados hasta la fecha sólo de manera parcial. Esto explica la gran neuroselectividad de las neurotoxinas clostridianas. Las estructuras cristalinas confirman que BoNT/A posee tres dominios que pueden explicar las tres etapas del mecanismo activo (véase Lacy et al. (1998) , Nat. Struct. Biol. 5, 898-902) . Estos datos permiten además concluir que dentro del fragmento HC existen dos subunidades autónomas (subdominios) de 25 kDa en cada caso. La primera prueba de la existencia de los dos subdominios funcionales fueron proporcionadas con la mitad del extremo amino (HCN) y la mitad del extremo carboxilo (HCC) del fragmento HC del TeNT, que fueron expresadas de manera recombinante y que permitieron descubrir que el dominio HCC, pero no el dominio HCN liga en neuronas (véase Herreros et al. (2000) , Biochem. J. 347, 199-204) . En un momento posterior se localizó un solo sitio de ligadura de gangliósido dentro del dominio HCC de BoNT/A y B y se caracterizó (véase Rummel et al. (2004) , Mol. Microbiol. 51, 631-643) . El sitio para la ligadura de la sinaptotagmina I y II identificada como receptor de proteína para BoNT/B y G pudo limitarse también a la región de los dominios HCC de BoNT/B y G (véase Rummel et al. (2004) , Mol. Microbiol. 279, 30865-70) . BoNT/A no muestra interacción de tipo alguno en células PC12 ni en estudios de ligadura de proteínas in Vitro con uno de los 13 miembros de la familia de proteínas de sinaptotagminas, conocidas en la actualidad.

La presente invención se basa, por lo tanto, en el objetivo que consiste en proporcionar unos medios y métodos para influir en la neurotoxicidad de BoNT/A.

El objetivo se logra proporcionando un polipéptido del dominio luminal (aminoácidos 454-579) de la glicoproteína 2C de la vesícula sináptica de Homo sapiens, que liga el fragmento Hc de la neurotoxina A botulínica. La presente invención se relaciona además con el uso del polipéptido como antagonista para la reducción de la neurotoxicidad de BoNT/A como auxiliar para la identificación de sustancias que reducen la ligadura de BoNT/A con células neuronales y la comprobación de BoNT/A en diferentes matrices.

Mediante la presente invención se presenta a continuación la proteína de la vesícula sináptica 2C (SV2C) como receptor para BoNT/A.

Se pudo demostrar en sus ensayos que ni la sinaptofisina, sinaptoporina, sinaptrogirina I & III, glicoproteína de la vesícula sináptica 2A (SV2A) ni la glicoproteína de la vesícula sináptica 2B (SV2B) funcionan... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado del dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens, ligando el polipéptido aislado el fragmento Hc de la neurotoxina botulínica A. 5

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se diferencia de la secuencia de aminoácidos de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de H. sapiens por la adición, sustitución, eliminación, inserción y/o inversión de por lo menos un aminoácido, pero no más de 5 aminoácidos, particularmente de no más de 1 aminoácido.

3. Ícido nucleico que codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Vector que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 3 y además un promotor apropiado para el control

de la expresión, estando el ácido nucleico que codifica el polipéptido bajo el control del promotor. 15

5. Célula huésped que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 3 y/o un vector según la reivindicación 4.

6. Procedimiento para la producción del polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica el polipéptido según la reivindicación 3 y/o de un vector

según la reivindicación 4 en una célula huésped apropiada y opcionalmente aislar el polipéptido producido de manera en sí conocida.

7. Composición que comprende por lo menos un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 2.

8. Anticuerpo para la reducción de la neurotoxicidad de BoNT/A en mamíferos, que reduce la ligadura de BoNT/A con la secuencia de aminoácidos del dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 50%, en particular por lo menos 80%, ligándose el anticuerpo a la secuencia de aminoácidos del dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la SV2C de Homo sapiens.

9. Anticuerpo según la reivindicación 8, para la reducción de la neurotoxicidad de BoNT/A en el botulismo, después de una sobredosis en un tratamiento terapéutico o aplicación cosmética de BoNT/A, intoxicación o para la prevención.

10. Anticuerpo según la reivindicación 8 ó 9, siendo el mamífero el Homo sapiens.

11. Molécula antisentido para la reducción de la neurotoxicidad de BoNT/A en mamíferos, que reduce la expresión del dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens.

12. Molécula antisentido según la reivindicación 11, para la reducción de la neurotoxicidad de BoNT/A en el botulismo, después de una sobredosis en un tratamiento terapéutico o una aplicación cosmética de BoNT/A, una intoxicación o para la prevención.

13. Molécula antisentido según una de las reivindicaciones 11 a 12, siendo el mamífero un Homo sapiens. 45

14. Procedimiento para la identificación de un anticuerpo o una molécula antisentido que reduce la ligadura de BoNT/A con el dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens, que comprende:

50 (a) poner en contacto un anticuerpo o una molécula antisentido con una solución de BoNT/A y GST-SV2V (454579) ;

(b) determinar la cantidad de GST-SV2V (454-579) ligada;

55 (c) seleccionar el anticuerpo o la molécula antisentido que reduce la cantidad de BoNT/A ligada a GST-SV2V (454579) .

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens está alojado en una membrana de plasma de una célula. 60

16. Procedimiento según la reivindicación 14 o 15, en el que la ligadura, reducida por la presencia del anticuerpo o de la molécula antisentido, de BoNT/A con la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens es detectada por la neurotoxicidad reducida del BoNT/A en el ensayo de semidiafragma de ratón.

17. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 2 y/o por lo menos un anticuerpo, ligándose el anticuerpo a la secuencia de aminoácido del dominio luminal (454-579) de la glicoproteína de la vesícula sináptica 2C de Homo sapiens.

18. Procedimiento para la detección de BoNT/A de Clostridium botulinum en una muestra cualquiera que comprende:

(a) inmovilizar un polipéptido en una fase sólida, presentando el polipéptido una secuencia de aminoácidos idéntica por lo menos en un 70% al dominio luminal (aminoácido.

45. 579) de la glicoproteína de la vesícula 10 sináptica 2C de Homo sapiens y que disminuye la ligadura de BoNT/A con SV2C;

(b) poner en contacto el polipéptido inmovilizado con una muestra en condiciones que permiten la ligadura de BoNT/A con el polipéptido;

(d) detectar el complejo o sus componentes.

(c) eluir el complejo de BoNT/A-polipéptido; y