Un procedimiento de purificación de biomoléculas que utiliza cromatografía de adsorción en lecho expandido,

que comprende introducir de forma discontinua con un pulsador de membrana elástica un extracto biológico en dicho lecho expandido que comprende una resina adsorbente, lavar las moléculas no adsorbidas en dicha resina adsorbente y eluir las biomoléculas adsorbidas en dicha resina adsorbente. El procedimiento de la invención puede aplicarse a la purificación de B-ficoeritrina a partir de extracto de proteínas de la microalga Phorphyridium cruentum.

PROCEDIMIENTO DE PURIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS QUE UTILIZA CROMATOGRAFíA DE ADSORCiÓN EN LECHO EXPANDIDO

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se enmarca de manera general en el sector químico, farmacéutico y alimentario. Específicamente, la presente invención está relacionada con un procedimiento de separación y purificación de biomoléculas, principalmente proteínas de alta pureza, en el que se utiliza cromatografía de adsorción en lecho expandido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN El pulsador de membrana elástica es un dispositivo que permite introducir una masa líquida en forma pulsante en un reactor químico, enzimático o fermentador, y se describe en la patente ES 2059228. El pulsador de membrana elástica está formado por un tubo flexible, una electroválvula y un temporizador, mediante el cual se controla el tiempo de cierre y de apertura de la válvula. Cuando se cierra la electroválvula el líquido queda retenido en la membrana flexible, aumentando la presión en la conducción. Cuando se abre la electroválvula el líquido almacenado en la membrana flexible se introduce rápidamente en el interior del equipo, logrando crear la pulsación.

El pulsador de membrana elástica puede trabajar a altas frecuencias para obtener una pulsación sin retro mezcla o a bajas frecuencias para conseguir el efecto contrario de producir retromezcla. El pulsador de membrana elástica tiene como función aumentar la velocidad del proceso de transformación en un equipo de fermentación, en un reactor enzimático o un reactor químico. La frecuencia elegida para aumentar la velocidad de transformación dependerá del proceso al que sea acoplado. El pulsador de membrana elástica se ha utilizado en fermentadores de lecho fijo, fermentadores anaerobios, biorreactores y extractores.

En la presente invención se utiliza el pulsador de membrana elástica en una cromatografía de adsorción en lecho expandido.

La cromatografía de adsorción en lecho expandido se realiza desde principios de los noventa (Chase, H. A. 1994. Purification of proteins by adsorption chromatography in expanded beds. Trends Biotechnol. 12: 296-303) . Esta tecnología, que combina las etapas de adsorción y concentración en la purificación de biomoléculas, consta de dos etapas: una primera etapa de adsorción de la biomolécula de interés en lecho expandido a partir de un extracto biológico filtrado o centrifugado y una segunda etapa de elución de la biomolécula de interés en lecho sedimentado, en la que el tampón eluyente circula desde el tope a la base de la columna, saliendo la biomolécula de interés purificada y concentrada por la base. A partir de un cultivo o extracto biológico clarificado, se produce la adsorción de la biomolécula de interés en el lecho expandido mientras que los restos de bioproductos salen de la columna. El alimento circula desde la base de la columna al tope pasando a través de un plato poroso o distribuidor. Esta tecnología está siendo ampliamente utilizada en la actualidad para recuperar biomoléculas directamente de cultivos de bacterias, de levaduras, de células animales, de extracto de microalgas, leche y cualquier otro tipo de extracto.

Las resinas Streamline comercializadas por la empresa CE Healthcare y las resinas Upfront Chromatography comercializadas por la empresa del mismo nombre son los adsorbentes cromatográficos más utilizados para obtener lechos expandidos estables.

Las patentes US 5, 522, 993 y US 6, 783, 962 describen las partículas de adsorción cromatográficas comercializadas por la empresa CE Healthcare y Upfront Chromatography, respectivamente. Ambos tipos de resinas se caracterizan por tener una densidad superior a la del agua lo que permite que puedan ser fluidizadas, permaneciendo en el interior de la columna. Las resinas comercializadas por Upfront son más resistentes físicamente, de un tamaño más pequeño y de mayor densidad que las resinas Streamline.

Las resinas comercializadas por Upfront Chromatography son muy resistentes a la ruptura siendo utilizadas en un tipo de columna también patentada y comercializada por la empresa Upfront Chromatography. Esta invención se describe en la solicitud de patente U.S 2006/0060533. Las columnas Upfront llevan en la base un distribuidor de aspas que gira para producir la mezcla. Las aspas tienen orificios por donde sale el extracto biológico. El giro de las aspas evita la formación de canales preferentes y permite la utilización de extractos sin centrifugar. La desventaja de la resina Upfront es su coste elevado lo que hace que se utilicen más las resinas Streamline en el proceso de adsorción en lecho expandido.

La patente US 5, 759, 395 describe las columnas de plato poroso comercializadas por CE Healthcare para ser utilizadas por las resinas Streamline. Las resinas Streamline tienen como ventaja que se adaptan perfectamente a columnas de plato poroso o cromatográficas que son más económicas y comercializadas por distintas empresas.

En la Figura 1, se muestra un diagrama de flujo de un proceso convencional de adsorción de biomoléculas en lecho expandido. Está formado por un adsorbente (resina Streamline) expandido en una columna cromatográfica y estabilizado inicialmente por una disolución tampón que fluye desde la base al tope de la columna con ayuda de dos bombas peristálticas colocadas en los extremos de la columna. Una vez estabilizado el lecho se cambia la disolución tampón por el extracto biológico centrifugado o filtrado para producirse la adsorción de la biomolécula de interés.

La desventaja del proceso convencional de cromatografía de adsorción en lecho expandido es la formación de canales preferentes por donde fluye el extracto biológico, desaprovechándose una parte del área de contacto que podría ofrecer el adsorbente. Estos canales preferentes son más persistentes con el aumento de la viscosidad del extracto biólogo. Para las resinas Streamline comercializadas por la empresa comercial CE Healthcare, la alternativa que se puede utilizar es diluir el extracto biológico para disminuir su viscosidad y de esta forma disminuir los canales preferentes (Bermejo, R. et al. 2003. Preparative purification of B-Phycoer y thrin from de microalga Phorphyridium cruentum expanded bed adsorption chromatography. Journal of Chromatography B. 490: 317-325) . La desventaja que presenta la dilución del extracto biológico es la disminución de la productividad (mg de biomolécula/ciclo) para un mismo volumen de alimento. Otra desventaja de las resinas Streamline es su fragilidad, no pueden ser utilizadas en las columnas diseñadas por Upfront Chromatography, se romperían con el giro de las aspas.

El problema del estado de la técnica es proveer un procedimiento cromatográfico alternativo de cromatografía en lecho expandido. La presente invención soluciona el problema técnico planteado mediante el procedimiento descrito en las reivindicaciones. El procedimiento de la invención mejora el contacto entre el extracto biológico y la resina adsorbente en lecho expandido respecto a los procedimientos cromatográficos en corriente continua, donde se forman canales preferentes por donde fluye el extracto biológico. Asimismo, el procedimiento de la invención es más económico que la cromatografía en lecho expandido con resinas y columnas Upfront.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención es un procedimiento de purificación de biomoléculas caracterizado por que utiliza cromatografía de adsorción en lecho expandido, que comprende: a) introducir de forma discontinua un extracto biológico en dicho lecho expandido que comprende una resina adsorbente, b) lavar las moléculas no adsorbidas en dicha resina adsorbente y c) eluir las biomoléculas adsorbidas en dicha resina adsorbente.

En el procedimiento de la invención, en la etapa a) se introduce de forma discontinua un extracto biológico en un lecho expandido que comprende una resina adsorbente, produciéndose la adsorción de la biomolécula de interés. En la etapa b) se lava el resto de las biomoléculas no adsorbidas en dicha resina adsorbente en lecho expandido y en la etapa c) se eluye la biomolécula de interés adsorbida en dicha resina adsorbente en lecho sedimentado.

Una ventaja de la invención es la mejora del contacto entre el extracto biológico y la resina adsorbente en lecho expandido respecto a un procedimiento en corriente continua.

Una cromatografía convencional de adsorción en lecho expandido se puede realizar utilizando una columna de plato poroso, resina Streamline, disolución tampón, extracto...

1. Un procedimiento de purificación de biomoléculas caracterizado por que utiliza cromatografía de adsorción en lecho expandido, que comprende: a) introducir de forma discontinua un extracto biológico en dicho lecho expandido que comprende una resina adsorbente, b) lavar las moléculas no adsorbidas en dicha resina adsorbente y c) eluir las biomoléculas adsorbidas en dicha resina adsorbente.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que en la etapa a) dicho extracto biológico se introduce con un pulsador de membrana elástica a una frecuencia de pulsación entre 0, 1 Y 4 S·l.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha frecuencia de pulsación es entre 0, 1 Y 0, 5 S·l .

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la viscosidad de dicho extracto biológico es entre 1, 5 Y 2, 5 mPa·s.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha resina adsorbente comprende agarosa, cuarzo y un adsorbente seleccionado del grupo compuesto por un intercambiador iónico, un adsorbente de afinidad y un adsorbente hidrofóbico.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho intercambiador iónico es DEAE.

7. El procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho adsorbente de afinidad se selecciona del grupo compuesto por un agente quelante, heparina y rproteína A.

8. El procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho adsorbente hidrofóbico comprende grupos fenilo.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que dicho extracto biológico es un extracto de proteínas de la microalga

Phorphyridium cruentum.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que la biomolécula eluida en la etapa c) es la proteína B-ficoeritrina.

Figurtl I

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