PSEUDOTRANSPOSONES Y SISTEMAS DE TRANSPOSICIÓN RECOMBINANTES HIPERACTIVOS, DERIVADOS DEL TRANSPOSÓN MOS-1.

Pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo, en el que a) por lo menos una de las dos repeticiones terminales no traducidas (UTR) y/o por lo menos una de las dos repeticiones terminales inversas (ITR) está(n) genéticamente modificada(s);

y b) una secuencia nucleotídica exógena de interés sustituye a la secuencia nucleotídica que codifica la tranposasa MOS-1 de origen, caracterizado porque se selecciona de entre los pseudo-transposones siguientes: α) ITR3'-UTR3'-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3'-ITR3'- (pseudo-transposón 33sec33), β) ITR3'-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3'-ITR3' (pseudo-transposón 2sec33), γ) ITR3'-UTR5'-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3'-ITR5' (pseudo-transposón 35sec35), δ) los pseudo-transposones que comprenden por lo menos una ITR40 de secuencia SEC ID nº 39, y ε) los pseudo-transposones que comprenden por lo menos una ITR46 de secuencia SEC ID nº 38, y en el que ITR3', UTR3', UTR5' e ITR5' designan respectivamente la secuencia de la repetición terminal inversa 3' del transposón Mos-1, la secuencia de la repetición terminal no traducida 3' del transposón Mos-1, la secuencia de la repetición terminal no traducida 5' del transposón Mos-1 y la secuencia de la repetición terminal inversa 5' del transposón Mos-1

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2007/000823.

Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS DE TOURS
.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 3, RUE MICHEL ANGE 75016 PARIS FRANCIA.

Inventor/es: BIGOT,Sylvie,Marie-Louise, BIGOT,Yves,Philippe,Marcel, BONNIN-ROULEUX,Florence, GERMON,Stéphanie,Odile,Rébecca, JEGOT,Gwenhael.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 15 de Mayo de 2007.

Clasificación PCT:

  • A61K48/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
  • C12N15/90 C12N 15/00 […] › Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma.
  • C12N9/22 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Ribonucleasas.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2374418_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular relativa a los elementos transposables. La invención se refiere más particularmente a la mejora de las propiedades de los sistemas de transposición MOS-1 para su utilización en biotecnología. La presente invención tiene por objeto un pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo, en el que: a) por lo menos una de las dos repeticiones terminales no traducidas (UTR) y/o por lo menos una de las dos repeticiones terminales inversas (ITR) está(n) genéticamente modificada(s); y b) una secuencia nucleotídica exógena de interés sustituye a la secuencia nucleotídica que codifica la tranposasa MOS-1 de origen, caracterizado porque se selecciona de entre los pseudo-transposones siguientes: ) ITR3-UTR3-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3-ITR3- (pseudo-transposón 33sec33), ß) ITR3-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3-ITR3 (pseudo-transposón 3sec33), ) ITR3-UTR5-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3-ITR5 (pseudo-transposón 35sec35), ) los pseudo-transposones que comprenden por lo menos una ITR40 de secuencia SEC ID nº 39, y ) los pseudo-transposones que comprenden por lo menos una ITR46 de secuencia SEC ID nº 38, y en los que ITR3, UTR3, UTR5 e ITR5 designan respectivamente la secuencia de la repetición terminal inversa 3 del transposón Mos-1, la secuencia de la repetición terminal no traducida 3 del transposón Mos-1, la secuencia de la repetición terminal no traducida 5 del transposón Mos-1 y la secuencia de la repetición terminal inversa 5 del transposón Mos-1. La presente invención tiene además por objeto un sistema de transposición recombinante hiperactivo del transposón Mos-1, que comprende por lo menos las dos parejas siguientes: a) un pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo según la reivindicación 1; y b) una transposasa Mos-1 suministrada en trans de dicho pseudo-transposón, en el que la frecuencia de transposición de dicha secuencia nucleotídica exógena de interés está mejorada en un factor por lo menos igual a 5, preferentemente por lo menos igual a 10, con respecto a la frecuencia de transposición de dicha secuencia nucleotídica exógena de interés contenida por un pseudo-transposón Mos-1 rodeado por dos ITR3 (3sec3) en presencia de la transposasa Mos-1 suministrada en trans. Además de dichos sistemas, la invención proporciona unas células hospedantes, unos kits y unas utilizaciones tales como se especifican en las reivindicaciones. La presente invención se refiere asimismo a la utilización de uno o varios de los medios anteriores para realizar unas transposiciones de secuencias, y más particularmente unas transferencias de genes, eficaces en una célula eucariota, con la excepción de una célula en un organismo humano o animal. Los elementos transposables (TE) o elementos genéticos móviles (EGM) son unos fragmentos de ADN de pequeño tamaño, capaces de desplazarse de un sitio cromosómico a otro (Renault et al., 1997). Estos fragmentos de ADN se caracterizan por unas secuencia repetidas inversas (ITR) situadas en las posiciones 5 y 3 terminales. Una enzima codificada por los propios TE, la transposasa, cataliza el proceso de transposición de estos últimos. Se han identificado unos TE tanto en los procariotas como en los eucariotas (véase una obra de referencia en este campo: Craig et al., 2002). Los TE se reparten en dos clases según sus mecanismos de transposición. Por un lado, los elementos de clase I, o retrotransposones, transponen a través de la transcripción inversa de un intermedio ARN. Por otro lado, los elementos de clase II transponen directamente de un sitio cromosómico a otro, a través de un intermedio ADN, según un mecanismo de tipo "copiar-pegar". En los procariotas, un gran número de TE han sido clasificados en la actualidad. Se pueden citar, por ejemplo, unas secuencias de inserción tales como IS1, y unos transposones, tal como Tn5. En los eucariotas, los elementos de clase II comprenden diez familias, P, PiggyBac, hAT, hélitron, Harbinger, En/Spm, Mutator, Transib, Pogo y Tc1-mariner. Los elementos genéticos móviles mariner (o MLE por "mariner-like elements") constituyen un gran grupo de TE de clase II, que pertenecen a la superfamilia Tc1-mariner (Plasterk et al., 1999). 2   La capacidad de las transposasas de TE para movilizar unos fragmentos de ADN más o menos largos, homólogos o heterólogos, que comprenden unas secuencias de interés, para insertarlos en unos ácidos nucleicos diana, en particular en el cromosoma de un hospedante, ha sido y sigue siendo ampliamente explotada en el campo de las biotecnologías, en particular en el campo de la ingeniería genética. Entre los TE, los MLE presentan unas propiedades particularmente ventajosas para una utilización en biotecnología, en particular en ingeniería genética y genómica funcional. Se pueden citar, por ejemplo, de manera no limitativa las propiedades siguientes: (i) los MLE son unos transposones de pequeño tamaño, fáciles de manipular. (ii) El mecanismo de transposición de los MLE es sencillo. En efecto, la transposasa es capaz de catalizar, por sí misma, todas las etapas de la transposición de los MLE. De hecho, es necesaria y suficiente para asegurar la movilidad de los MLE en ausencia de factores del hospedante (Lampe et al., 1996). (iii) Los MLE se caracterizan por una ubiquidad muy amplia en los procariotas y en los eucariotas. El primer MLE, Dmmar1, denominado asimismo Mos-1, ha sido descubierto en Drosophila mauritiana por Jacobson y Harti (1985). A continuación, se han identificado numerosos elementos emparentados en unos genomas que pertenecen en particular a bacterias, protozoarios, hongos, plantas, invertebrados, vertebrados de sangre fría y mamíferos. (iv) La actividad transcripcional de los MLE es altamente específica, y no induce ningún mecanismo de "resistencia" del genoma del hospedante, tales como unos fenómenos de interferencias por metilación [MIP; Jeong et al. (2002); Martienssen y Colot (2001)] o a través de unos ARN [RNAi; Ketting et al. (1999); Tabara et al. (1999)]. Los eventos de transposición pueden ser controlados mediante diversos factores, tales como la temperatura, la presencia de ciertos cationes divalentes y el pH. En términos de estructura, el elemento Mos-1 de mariner es un elemento compacto de 1286 pb que contiene un solo marco abierto de lectura (ORF) que codifica para una transposasa de 354 aminoácidos. La transposasa está constituida por un dominio N-terminal implicado en la unión al ADN, la dimerización y la tetramerización y por un dominio C-terminal que contiene el sitio activo en el que un motivo DDE(D) coordina el ión metálico catalítico. El marco de lectura está flanqueado por dos secuencias terminales inversas (ITR) de 28±2 pb. Las dos regiones localizadas entre las ITR y el ORF no están traducidas y se denominan UTR (por "Untranslated Terminal Region"). Las dos ITR de Mos-1 difieren en secuencia por cuatro nucleótidos, lo cual deja pensar que la configuración natural de este elemento no es óptima para la transposición. Esto ha sido verificado de hecho por unos experimentos que muestran que un pseudo-transposón rodeado por dos ITR 3 de Mos-1 transpone 10.000 veces mejor in vivo en bacteria que el rodeado por las ITR 5 y 3 en configuración natural (Augé-Gouillou et al., 2001b). Las aplicaciones potenciales de los MLE en biotecnología, en particular como herramientas no víricas de recombinación genética, son considerables. Típicamente, para unas aplicaciones de mutagénesis de inserción in vitro, el gen del transposón que codifica para la transposasa se sustituye por un ADN "etiqueta". La transposasa se suministra en trans en forma proteica. Para unas aplicaciones de transferencia de genes in vivo o in vitro, el gen que codifica la transposasa se sustituye por el ADN exógeno a transferir (se obtiene así un "pseudo-transposón"). La transposasa se suministra entonces en trans a través de un plásmido de expresión, un ARN mensajero o la propia proteína. Sin embargo, la transferencia de un ADN exógeno con la ayuda de los medios actuales, es decir utilizando un pseudo-transposón mariner, no deja de plantear dificultades, en particular debido a una eficacia y a una especificidad de integración del transgén muy limitadas. El documento de Pledger D y Coates C (2005) en Insect Biochemistry and Molecular Biology vol. 35 p. 1199- 1207 describe el aumento de la actividad de transposición de un pseudo-transposón Mos-1 cuando se utiliza una transposasa Mos-1 mutada hiperactiva en combinación con un pseudo-transposón hiperactivo 3T3 (según la terminología de la presente solicitud). El documento de Augé-Gouillou C et al (2001b) en Molecular Genetics and Genomics vol. 265 p.51-57 describe que la afinidad de la transposasa Mos-1 para la ITR3 es superior a aquella para ITR5, y que la actividad de transposición... 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Reivindicaciones:

a) por lo menos una de las dos repeticiones terminales no traducidas (UTR) y/o por lo menos una de las dos repeticiones terminales inversas (ITR) está(n) genéticamente modificada(s); y b) una secuencia nucleotídica exógena de interés sustituye a la secuencia nucleotídica que codifica la tranposasa MOS-1 de origen, caracterizado porque se selecciona de entre los pseudo-transposones siguientes: ) ITR3-UTR3-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3-ITR3- (pseudo-transposón 33sec33), ß) ITR3-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3-ITR3 (pseudo-transposón 2sec33), ) ITR3-UTR5-secuencia nucleotídica exógena de interés-UTR3-ITR5 (pseudo-transposón 35sec35), ) los pseudo-transposones que comprenden por lo menos una ITR40 de secuencia SEC ID nº 39, y ) los pseudo-transposones que comprenden por lo menos una ITR46 de secuencia SEC ID nº 38, y en el que ITR3, UTR3, UTR5 e ITR5 designan respectivamente la secuencia de la repetición terminal inversa 3 del transposón Mos-1, la secuencia de la repetición terminal no traducida 3 del transposón Mos-1, la secuencia de la repetición terminal no traducida 5 del transposón Mos-1 y la secuencia de la repetición terminal inversa 5 del transposón Mos-1. 2. Sistema de transposición recombinante hiperactivo derivado del transposón Mos-1, que comprende por lo menos las dos parejas siguientes: a) un pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo según la reivindicación 1; y b) una transposasa Mos-1 suministrada en trans de dicho pseudo-transposón, en el que la frecuencia de transposición de dicha secuencia nucleotídica exógena de interés está mejorada en un factor por lo menos igual a 5, preferentemente por lo menos igual a 10, con respecto a la frecuencia de transposición de dicha secuencia nucleotídica exógena de interés contenida por un pseudo-transposón Mos-1 rodeado de dos ITR3 (3sec3) en presencia de la transposasa Mos-1 suministrada en trans. 3. Sistema según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha transposasa Mos-1 suministrada en trans es una transposasa mutante. 4. Sistema según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha transposasa Mos-1 mutante es hiperactiva. 5. Sistema según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha transposasa Mos-1 mutante hiperactiva comprende por lo menos una mutación a nivel de por lo menos un residuo seleccionado de entre los residuos siguientes de la secuencia SEC ID nº 2: F53, Q91, E137, T216 e Y237. 6. Sistema según la reivindicación 5, caracterizado porque comprende por lo menos las dos parejas siguientes: a) un pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo que comprende por lo menos una ITR40 de secuencia SEC ID nº 39 y una transposasa Mos-1 mutante hiperactiva que comprende las mutaciones T216A e Y237C; b) un pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo que comprende por lo menos una ITR46 de secuencia SEC ID nº 38 y una transposasa Mos-1 mutante hiperactiva que comprende las mutaciones T216A e Y237C, o E137K y T216A, o F53Y e T216A e Y237C; c) un pseudo-transposón Mos-1 hiperactivo 3sec33 y una transposasa Mos-1 mutante hiperactiva que comprende las mutaciones T216A e Y237C, o E137K y T216A, o también F53Y e Q91R, o F53Y y Q91R y E137K y T216A. 7. Pseudo-transposón según la reivindicación 1 o sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica exógena de interés es un gen funcional. 8. Vector que comprende por lo menos un pseudo-transposón según la reivindicación 1. 9. Célula hospedante que comprende por lo menos: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7, o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o 37   d) una combinación de éstos. 10. Kit que comprende por lo menos: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7; o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o d) una célula hospedante según la reivindicación 9; o e) una combinación de éstos. 11. Utilización de por lo menos: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7; o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o d) una célula hospedante según la reivindicación 9; o e) un kit según la reivindicación 10; o f) una combinación de éstos. para la transposición eficaz in vitro o ex vivo de una secuencia nucleotídica exógena de interés. 12. Utilización de por lo menos: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7; o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o d) una célula hospedante según la reivindicación 9; o e) un kit según la reivindicación 10; o f) una combinación de éstos. para la mutagénesis de inserción in vitro o ex vivo. 13. Utilización de por lo menos: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7; o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o d) una célula hospedante según la reivindicación 9; o e) un kit según la reivindicación 10; o f) una combinación de éstos. para la secuenciación y/o la clonación de ácidos nucleicos. 14. Procedimiento de preparación de un medicamento, que comprende por lo menos una etapa de transposición in vitro o ex vivo de una secuencia de ADN transposable de interés en una secuencia de ADN diana, siendo dicha transposición mediada por lo menos por uno de los medios siguientes: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7; o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o 38   d) una célula hospedante según la reivindicación 9; o e) un kit según la reivindicación 10; o f) una combinación de éstos. 15. Utilización de por lo menos: a) un pseudo-transposón según la reivindicación 1 ó 7; o b) un sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; o c) un vector según la reivindicación 8; o d) una célula hospedante según la reivindicación 9; o e) un kit según la reivindicación 10; o f) una combinación de éstos. para la preparación de un medicamento destinado a permitir la transposición eficaz in vivo de una secuencia nucleotídica exógena de interés. 39

 

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