Proteínas variantes de osteoprotegerina.

Variante de osteoprotegerina (OPG) de tipo natural en la que la secuencia de la variante comprende al menos una sustitución de aminoácido dentro de la región englobada por los aminoácidos 102-130 en comparación con la secuencia de la OPG de tipo natural tal como se muestra en SEQ ID NO:

2, conservando la variante la afinidad de unión por RANKL pero mostrando afinidad de unión reducida por TRAIL en comparación con la OPG de tipo natural.

Proteínas variantes de osteoprotegerina Campo de la invención La presente invención se refiere proteínas evolucionadas que son útiles en la regulación de efectos biológicos mediados a través de la interacción de RANK y RANKL. Más particularmente, la invención se refiere a proteínas variantes de osteoprotegerina (OVP) novedosas que tienen especificidades de unión alteradas en comparación con la osteoprotegerina de tipo natural. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para estas OVP. También se engloban vectores recombinantes y células huésped que expresan estas OVP, así como métodos de producción de OVP recombinantes. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden estas OVP, y a métodos de tratamiento de enfermedades asociadas con el efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL.

Antecedentes de la invención El eje bioquímico de ligando de Rank (RANKL) /OPG/RANK se ha dirigido satisfactoriamente para tratar la osteoporosis, la artritis reumatoide, la destrucción ósea inducida por cáncer, la metástasis, la hipercalcemia y el dolor (Hofbauer et al., Cancer 92 (3) : págs. 460-470 (2001) . También están en desarrollo terapias que utilizan OPG (Honore et al., Nature Medicine 6 (5) :521-528 (2000) ) , un anticuerpo dirigido frente a RANKL, o la proteína soluble RANK-Fc (Oyajobi et al., Cancer Res 61 (6) : págs. 2572-8 (2001) ) . Constructos proteicos de RANK-Fc soluble y OPG se unen a RANKL, disminuyendo de ese modo la cantidad de RANKL que está disponible para la activación del receptor RANK.

Además de ser importante en la biología ósea, RANKL desempeña un papel en el sistema inmunitario regulando las respuestas de células T específicas de antígeno (Anderson et al., Nature 390 (6656) :175-9 (1997) ) . RANKL se expresa altamente en células T activadas, mientras que el receptor RANK se expresa en altos niveles en células dendríticas (DC) maduras. La interacción entre RANKL y RANK actúa como una señal coestimuladora, que potencia la supervivencia de DC y la proliferación de las células T induciendo la diferenciación de DC, la producción de citocinas y la reducción de la apoptosis en ambos tipos de células. Puede lograrse inmunoterapia para producir tolerancia a tejidos y/u órganos trasplantados mediante el bloqueo de la señal coestimuladora usando antagonistas de RANK. El bloqueo de la coestimulación evita la activación de las células T por las DC y hace que las células T alorreactivas se conviertan en anérgicas y/o experimenten apoptosis (Adler et al., Current Opinion in Immunology 14:660-665 (2002) ) . Mediante un mecanismo de acción similar, antagonizar la señalización de RANK podría ser un tratamiento para trastornos inflamatorios autoinmunitarios y mediados por el sistema inmunitario tales como lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante.

La osteoprotegerina (OPG) es una proteína de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) y se describió por primera vez por Simonet et al. (Cell, 89, 309-319 (1997) ) .

La OPG parece ser un elemento crucial en la regulación de los procesos naturales de la producción y el recambio óseos. Se han observado cambios en el equilibrio entre OPG y su receptor diana RANKL en varios estados asociados con metabolismo óseo anómalo.

La OPG se ha sometido a pruebas preclínicas y clínicas con posibilidades de aplicación en diversos estados asociados con un aumento del recambio óseo y la pérdida ósea, incluyendo osteoporosis, artritis reumatoide, enfermedad de Paget, enfermedad periodontal, enfermedad vascular y cánceres que se ubican en o han metastatizado el hueso (Para revisión, véase Lorenz et al., J. Amer Med Assoc 292: 490-5 (2004) y referencias en el mismo) . Se notifican en la bibliografía pruebas exhaustivas en animales de OPG, que indican un rendimiento igual o superior en comparación con otras terapias usadas actualmente para reducir la pérdida ósea (Simonet et al., Cell, 89, 309-319 (1997) ; Bolon et al., Cell Mol Life Sci 59, 1569-76 (2002) ) . También se ha demostrado que OPG reduce el dolor asociado a cánceres de huesos (Luger et al., Cancer Research 61, 4038-4047 (2001) ) .

La OPG se describe en detalle en los documentos US 6.015.938, US 6.284.740, US 6.284.728, US 6.613.544, US 6.316.408, US 6.288.032 y US 6.369.027. En el documento US 6.087.555 se describen ratones transgénicos que carecen de expresión de OPG.

La OPG se ha sometido a ensayos de fase I tanto en pacientes con mieloma múltiple como en pacientes con osteoporosis para determinar la reducción del recambio óseo. En estudios preliminares de fase I/II en mujeres posmenopáusicas que padecen osteoporosis, se encontró que una única inyección de OPG suprime los marcadores del recambio óseo en un 30-80% durante varios días (Bekker et al., J. Bone Miner Res 16, 348-360 (2001) ) . Se trataron pacientes con mieloma múltiple con una variedad de dosis de OPG, y se demostró una disminución de hasta el 50% en la resorción ósea durante 30 o más días (Body et al., Cancer 97, 887-892 (2003) ) . Por tanto, hay una evidencia muy fuerte, tanto a partir de estudios preclínicos como de estudios clínicos, de que es probable que OPG sea un tratamiento altamente eficaz en una variedad de estados caracterizados por metabolismo óseo anómalo.

La familia de citocinas del factor de necrosis tumoral (TNF) y sus receptores correspondientes contiene un número de miembros considerable y existe una reactividad cruzada sustancial entre los miembros en las interacciones ligando-receptor (para revisión, véase Igney, F.H. y Krammer, P.H Nature Reviews Cancer 2, 277-288 (2002) ) . Los receptores del TNF generalmente desencadenan uno de dos tipos de respuesta, o bien una respuesta apoptótica (muerte celular programada) o bien un efecto sobre rutas metabólicas celulares a través de la activación del factor de transcripción NFkB. La familia de receptores también contiene miembros que actúan como señuelos para reducir la eficacia de la interacción entre otros pares ligando-receptor de la familia. La OPG parece encontrarse en esta clase de receptores.

En comparación con muchos miembros de la familia de receptores del TNF, la OPG está relativamente limitada en su especificidad de diana. Según el conocimiento actual, la OPG se uno sólo a dos ligandos de tipo TNF:

1. RANKL (ligando del receptor activador de NFkB) , una molécula de la superficie celular de tipo TNF que normalmente interacciona con un miembro de la familia de receptores del TNF, RANK, que se expresa en precursores de osteoclastos, células dendríticas, células T y precursores hematopoyéticos (Kong et al., Nature 397:315-323 (1999) . RANKL interacciona con RANK en las superficies celulares para estimular la producción y la actividad de los osteoclastos, las principales células implicadas en el recambio óseo (Hsu, H et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 3540-3545 (1999) ) . RANKL se expresa en células estromales/osteoblastos (Kong et al., Nature 397:315-323 (1999) ) . La interacción de OPG con RANKL inhibe la capacidad de RANKL para unirse a RANK y estimular a los osteoclastos y es esta actividad de OPG la que confiere su capacidad para reducir la pérdida ósea (Lacey et al., Amer J Pathol 157, 435-448 (2000) ; Simonet et al., Cell, 89, 309-319 (1997) ) . Se ha notificado que la constante de unión de OPG dimérica que se une a RANKL es de 6, 7 nM (Willard et al., Protein Expr. Purif 20, 48-57 (2000) ) situando otros informes la constante de unión entre 2 y 10 nM.

2. TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF) , una molécula de la superficie celular de tipo TNF implicada en la inducción de la apoptosis en células cancerosas. Se considera que la OPG es uno de un número pequeño de receptores señuelo para TRAIL, que actúa para modular su capacidad para dirigirse a células cancerosas (Revisado en Igney y Krammer (2002) tal como se mencionó anteriormente) . Por tanto, se esperaría que la OPG potenciara la supervivencia de las células cancerosas si está presente en un sitio relevante en cantidades suficientes, y se ha documentado su capacidad para aumentar la supervivencia de células tumorales (por ejemplo, Neville-Webbe et al, Breast Cancer Res Treat. 86, 271-82 (2004) ; Holen I et al, Cancer Res 62, 1619-1623 (2002) ) . Se ha notificado que la afinidad de OPG por TRAIL es de 3 nM (Emer y et al, J. Biol Chem. 273, 14363-7 (1998) ) aunque esto puede variar con la temperatura (Truneh et al, J. Biol Chem. 275, 23319-25 (2000) ) .

La capacidad de la OPG para inhibir la... [Seguir leyendo]

1. Variante de osteoprotegerina (OPG) de tipo natural en la que la secuencia de la variante comprende al menos una sustitución de aminoácido dentro de la región englobada por los aminoácido.

10. 130 en comparación con la secuencia de la OPG de tipo natural tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, conservando la variante la afinidad de unión por RANKL pero mostrando afinidad de unión reducida por TRAIL en comparación con la OPG de tipo natural.

2. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 1, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición de residuo 102, 111, 115, 122, 128 ó 130.

3. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 2, que comprende al menos una sustitución dentro de la estructura de bucle que comprende los residuo.

10. 118.

10 4. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 3, que comprende una sustitución en el residuo 115.

5. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 4, en la que Ile en la posición 115 se sustituye por Thr, Met, Val, Asp, Gly, Ser o Arg.

6. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 2, en la que Arg en la posición 122 se sustituye por Gly, Gln, Ser, Asn o Glu.

15 7. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 2, en la que Phe en la posición 128 se sustituye por Val, Ala, Leu, Ile o Ser.

8. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 2, en la que Val en la posición 130 se sustituye por Glu o Ala.

9. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 1, que comprende al menos dos sustituciones en la 20 región englobada por los residuo.

10. 130.

10. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 9, que comprende al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) R122N y 1115M;

(ii) R122E y 1115M;

(iii) F128S y 1115M;

(iv) F128I y 1115M; y

(v) F128L y 1115M.

11. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 1, que comprende al menos una sustitución en la región englobada por los residuo.

12. 130 y al menos una sustitución adicional fuera de esta región.

12. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 11, en la que la sustitución adicional se produce en uno cualquiera o más de los residuos 31, 40, 51, 100, 155, 167 ó 168.

13. Variante de OPG de tipo natural según la reivindicación 11, en la que la sustitución adicional se produce en uno cualquiera o más de los residuos Gln21, Glu22, Thr23, Phe24, Pro25, Pro26, Lys27, Tyr28, Leu29, His30, Tyr31, Asp32, Glu33, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Gln38, Asp42, Lys43, Pro45, Pro46, Thr48, Lys51, Gln52, His53, Cys54, 35 Thr55, Ala56, Lys57, Trp58, Lys59, Thr60, Val61, Ala63, Pro64, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Asp72, Ser73, Trp74, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Leu81, Tyr82, Ser84, Pro85, Val86, Lys88, Glu89, Leu90, Tyr92, Val93, Lys94, Gln95, Glu96, Asn98, Arg99, Thr100, His101, Val131, Gln132, Ala133, Gly134, Thr135, Pro136, Glu137, Arg138, Val141, Lys143, Arg144, Cys145, Pro146, Asp147, Gly148, Phe149, Phe150, Ser151, Asn152, Glu153, Thr154, Ser155, Ser156, Lys157, Ala158, Pro159, Cys160, Arg161, Lys162, His163, Thr164, Asn165, Cys166, Ser167, Val168, Phe169, Gly170, Leu171, Leu172, Leu173, Thr174, Gln175, Lys176, Gly177, Asn178, Ala179, Thr180, His181, Asp182, Asn183, Ile184, Cys185, Ser186, Gly187, Asn188, Ser189, Glu190, Ser191, Thr192, Gln193, Lys194, Cys195, Gly196, Ile197, Asp198, Val199, Thr200 o Leu201.

14. Variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende una cualquiera o más de las sustituciones mostradas en la tabla 1.

15. Variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la proteína variante de OPG está conjugada a un polipéptido.

16. Dímero o multímero que comprende al menos dos variantes de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

17. Polinucleótido aislado que codifica para una variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

18. Método para reducir la afinidad de unión de OPG por TRAIL, comprendiendo el método modificar al menos un aminoácido seleccionado de los residuos 102, 111, 115, 122, 128, 130 de OPG de tipo natural para producir una variante de OPG de tipo natural o fragmento de la misma para producir una proteína variante de OPG, y someter a prueba la proteína variante de OPG para determinar la afinidad de unión por TRAIL.

19. Uso de una variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la fabricación de un medicamento para inhibir o reducir un efecto biológico mediado a través de la interacción de RANK y RANKL en una célula.

20. Variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en terapia.

21. Uso de una variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad inflamatoria autoinmunitaria o mediada por el sistema inmunitario.

22. Uso de una variante de OPG de tipo natural según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad cardiovascular.