Proteína transportadora para la introducción de compuestos químicos en neuronas.

Proteína transportadora, obtenible mediante la modificación de la cadena pesada de la neurotoxina formada porClostridium botulinum,

en la que la neurotoxina es la neurotoxina Botulinum tipo A (BoNT/A) y en la que la proteínatransportadora se une con las neuronas con una afinidad mayor que la neurotoxina nativa, siendo determinada laactividad de unión en el ensayo en sinaptosomas, y siendo por lo menos un aminoácido en las posiciones 1117,1252, 1253, 1270, 1278 a 1279 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina Botulinum tipo A eliminado osustituido por un aminoácido, que existe en estado natural o que no es de origen natural.

Proteína transportadora para la introducción de compuestos químicos en neuronas.

La presente invención se refiere a una proteína transportadora definida según las reivindicaciones que se proporcionan a continuación, que se une a las neuronas, que es absorbida por endocitosis mediada por el receptor y que es traslocada del compartimiento endosomal ácido al citosol de las neuronas. Esta proteína se usa como vehículo que trasloca otras sustancias químicas (por ejemplo, proteasas) que no pueden penetrar por la membrana del plasma al citosol de neuronas. La presente invención se refiere al uso de una proteína transportadora para inhibir la liberación de neurotransmisores.

Las neuronas liberan las sustancias de transmisores a través de la exocitosis. Por exocitosis se entiende la fusión de la membrana de vesículas intracelulares con la membrana del plasma. Durante este proceso, se eyecta simultáneamente el contenido vesicular en al intersticio sináptico. La fusión de ambas membranas se regula mediante el calcio que reacciona con la proteína sinaptotagmina. Junto con otros factores, la sinaptotagmina controla es estado de tres proteínas de fusión, la SNAP-25, la sinaptobregina 2 y la sintaxina 1A. Mientras la sintaxina 1A y la sinaptobrevina 2 están integradas en la membrana del plasma respectivamente de la vesícula, la SNAP-25 está unida sólo débilmente con la membrana de plasma. Cuando la concentración de calcio intracelular aumenta, las tres proteínas se unen entre sí, acercándose ambas membranas y finalmente se fusionan entre sí. En las neuronas colinérgicas, se libera acetilcolina que causa contracciones musculares, secreción de sudor y otras reacciones mediadas colinérgicamente.

Las proteínas de fusión mencionadas anteriormente son moléculas blanco (sustratos) de las cadenas ligeras de las neurotoxinas de clostridia que son formadas por la bacteria Clostridium botulinum.

La bacteria Clostridium botulinum anaeróbica, gram positiva produce siete diferentes tipos de neurotoxinas proteínicas, que se denominan neurotoxinas Botulinus (BoNT/A a BoNT/G) . De éstas, en particular BoNT/A y BNT/B causan enfermedades neuroparalíticas en el ser humano y en animales, que se denominan botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en la tierra, pero pueden desarrollarse en conservas alimenticias esterilizadas y cerradas inadecuadamente de producción casera, que son consideradas la causa de muchos casos de botulismo.

BoNT/A es la más letal de todas las sustancias biológicas conocidas. Sólo aproximadamente 5-6 pg de BoNT/A purificada es una MLD (Multiple Low Dose, dosis baja múltiple, por sus siglas en inglés) . Una unidad (inglés Unit, U) de BoNT es definida como la MLD que después de la inyección intraperitoneal mata a la mitad de los ratones Swiss Webster hembra con un peso de 18-20 g, en cada caso. Se caracterizaron siete BoNT inmunológicamente distintas. Se les designa BoNT/A, B, C1, D, E, F y G y se pueden distinguir por la neutralización con el serotipo de anticuerpos específicos. Los diferentes serotipos se diferencian en las especies de animales concernientes con relación a la gravedad y la duración de la parálisis causada. Así, en el caso de la rata, por ejemplo, BoNT/A es 500 veces más activo, en cuanto a una parálisis, que BoNT/B. En adición a esto, la NoNT/B ha mostrado ser no toxica en primates en dosis de 480 U/kg peso corporal. La misma cantidad de BoNT/A corresponde a 12 veces la dosis letal (LD) de esta sustancia en primates. Por otro lado, en el caso de ratones, la duración de la parálisis después de inyección de BoNT/A es 10 veces mayor que después de la inyección de BoNT/E.

Las BoNT se han empleado clínicamente para el tratamiento de disfunciones neuromusculares que se caracterizan por la hiperactividad en los músculos del esqueleto, causada por nervios periféricos patológicamente superactivos. La BoNT/A es autorizada por la US Food and Drug Administration para el tratamiento de blefarospasmo, estrabismo y espasmos hemifaciales. En comparación con la BoNT/A, los demás serotipos de BoNT poseen aparentemente una actividad menor y una duración menor de actividad. Los efectos clínicos de la BoNT/A administrada en forma intramuscular periférica se presentan usualmente dentro de una semana. La duración de la inhibición de síntomas por una sola inyección intramuscular de BoNT/A se prolonga normalmente unos 3 meses.

Las neurotoxinas de clostridia hidrolizan diferentes proteínas específicas del aparato de fusión. BoNT/A, C1 y E desintegran la SNAP-25, mientras que BoNT/B, D, F, G, así como la neurotoxina del tétano (TeNT) atacan la proteína de membrana asociada con la vesícula (VAMP) 2, denominada también sinaptobrevina 2. BoNT/C1 desintegra además la sintaxina 1A.

Las bacterias de clostridia liberan las neurotoxinas como polipéptidos de una sola cadena con 1251 a 1315 aminoácidos en cada caso. A continuación, unas proteasas endógenas separan cada una de estas proteínas en un sitio determinado en 2 cadenas en cada caso (‘nicking’) , permaneciendo unidas, sin embargo, ambas cadenas entre sí mediante un puente de bisulfuro. Estas proteínas de dos cadenas se denominan holotoxinas (Cf. Shone et al (1985) , Eur J Biochem 151, 75-82) . Las dos cadenas tienen diferentes funciones. Mientras la parte menor, la cadena ligera (light chain = LC) , representa una endoproteasa dependiente de Zn2+, la unidad mayor (heavy chain = HC) es el transportador de la cadena ligera. Mediante el tratamiento de la HC con endopeptidasas se produjeron dos fragmentos kDa (Cf. Gimenez et al. (1993) , J Protein Chem 12, 351-363) . La mitad amino terminal (fragmento HN) se integra a un valor pH bajo en las membranas y ayuda a la LC a penetrar en el citosol de la neurona. La mitad carboxi

terminal (fragmento HC) se une con los polisialogangliósidos que están presentes sólo en las membranas de neuronas y en receptores de proteínas hasta ahora no identificadas (Halpern et al. (1993) , Curr Top Microbiol Immunol 195, 221-241) . Esto explica la neuroselectividad alta de las neurotoxinas de clostridia. Las estructuras de cristales confirman que la BoNT/A dispone de tres dominios que pueden asociarse con las tres etapas del mecanismo de actividad (Cf. Lacy et al. (1998) , Nat Struct Bio 5, 898-902) . Estos datos permiten además concluir que existen dos unidades subordinadas autónomas (subdominios) dentro del fragmento HC con 25 kDa cada una. La primera prueba de la existencia de los dos subdominios funcionales se logró con la mitad amino terminal (HCN) y la mitad carboxi terminal (HCC) del fragmento HC del TeNT que fueron expresados en forma recombinante y que permitieron apreciar que el dominio HCC ciertamente se une con las neuronas, pero no el dominio HCN (Cf. Herrero et al. (2000) , Biochem J 347, 199-204) . El sitio de adhesión del receptor de proteína de la sinaptotagmina se descubrió dentro de los dominios HCC de BoNT/B y G, lo que mostró su funcionalidad separada (Cf. Rummel et al. (2004) , J. Biol Chem 279, 30865-70) .

En condiciones fisiológicas, la HC se une con los gangliósidos neuronales, es captada mediante endocitosis mediada por el receptor en el interior de la célula y llega al ciclo de vesícula natural a través del compartimiento endosomal. En el ambiente ácido de los primeros endosomas, la HN, la mitad amino terminal de HC, penetra en la membrana de la vesícula y forma un poro. Cada sustancia (X) que está unida con HC a través de un puente de bisulfuro, será separada de la HC por los sistemas de redox intracelulares que obtienen acceso al puente de bisulfuro y lo reducen. X aparecerá finalmente en el citosol.

En el caso de las neurotoxinas de clostridia, la HC es el portador de una LC que separa en la etapa final su sustrato específico en el citosol. El ciclo de la formación y disociación de complejo de las proteínas de fusión es interrumpido y se inhibe así la liberación de acetilcolina. Como consecuencia de ello, se paralizan los músculos estriados y las glándulas sudoríparas paran su secreción. La duración del efecto de los serotipos individuales de BoNT es variable y depende de la presencia de la LC intacta en el citosol. Puesto que todas las neuronas poseen receptores para las neurotoxinas de clostridia, no es sólo la liberación de acetilcolina, la que puede verse afectada, sino potencialmente también la liberación de la sustancia P, de noradrenalina, de GABA, glicina, endorfina y de otros transmisores y hormonas.

El hecho de que se bloquee preferentemente la transmisión colinérgica puede explicarse porque la HC... [Seguir leyendo]

1. Proteína transportadora, obtenible mediante la modificación de la cadena pesada de la neurotoxina formada por Clostridium botulinum, en la que la neurotoxina es la neurotoxina Botulinum tipo A (BoNT/A) y en la que la proteína transportadora se une con las neuronas con una afinidad mayor que la neurotoxina nativa, siendo determinada la actividad de unión en el ensayo en sinaptosomas, y siendo por lo menos un aminoácido en las posiciones 1117, 1252, 1253, 1270, 1278 a 1279 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina Botulinum tipo A eliminado o sustituido por un aminoácido, que existe en estado natural o que no es de origen natural.

2. Proteína transportadora, obtenible mediante la modificación de la cadena pesada de la neurotoxina tipo A de Clostridium botulinum (BoNT/A) , en la que la proteína transportadora se une con las neuronas con una afinidad mayor que la neurotoxina nativa, siendo determinada la actividad de unión en el ensayo en sinaptosomas, y siendo reemplazados los aminoácidos 1092 a 1296 de la neurotoxina tipo A de Clostridium botulinum, que contienen los dominios de unión a los gangliósidos, por las secuencias siguientes:

proteína de neurotoxina tipo B de Clostridium botulinum, aminoácidos 1079 a 1291, o proteína de neurotoxina tipo C1 de Clostridium botulinum, aminoácidos 1093 a 1291, o dominio Hcc de la proteína de neurotoxina de Clostridium tetani.

3. Proteína transportadora, obtenible mediante la modificación de la cadena pesada de la neurotoxina tipo A de Clostridium botulinum (BoNT/A) , en la que la proteína transportadora se une con las neuronas con una afinidad mayor que la neurotoxina nativa, siendo determinada la actividad de unión en el ensayo sobre sinaptosomas, y siendo reemplazado el fragmento Hc de BoNT/A completo (aminoácidos 867 a 1296) por el fragmento Hc de BoNT/B (aminoácidos 866 a 1291) .

4. Proteína transportadora según la reivindicación 1, 2 o 3, en la que la proteína transportadora se une específicamente con las neuronas y es captada por las células mediante endocitosis.

5. Proteína transportadora según la reivindicación 1, 2 o 3, en la que la proteína transportadora se une específicamente con los gangliósidos complejos de las neuronas motores colinérgicas, que se ubican en la membrana de plasma, preferentemente con GT1b.

6. Proteína transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína transportadora posee una afinidad por lo menos un 15% mayor que la neurotoxina nativa, preferentemente por lo menos un 50%, de manera particularmente preferida por lo menos un 80 %, particularmente por lo menos un 90%.

7. Proteína transportadora según la reivindicación 1, en la que el aminoácido en la posición 1117 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina Botulinum tipo A es eliminado o sustituido por un aminoácido, que existe en estado natural o que no es de origen natural.

8. Proteína transportadora según la reivindicación 7, en la que el aminoácido sustituido es alanina, cisteína, glutamato, fenilalanina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina o valina.

9. Proteína transportadora según la reivindicación 7, en la que el aminoácido sustituido es alanina, cisteína o valina.

10. Proteína transportadora según la reivindicación 1, en la que el aminoácido de las secuencias de proteínas de la neurotoxina Botulinum tipo A es sustituido en la posición 1252 por tirosina o por lisina en la posición 1253.

11. Proteína transportadora según la reivindicación 1, en la que dos o tres aminoácidos, seleccionados de entre las posiciones 1117, 1252, 1253, 1270, 1278 a 1279 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina Botulinum tipo A son eliminados o sustituidos, preferentemente las posiciones 1117/1252, 1117/1253, 1117/1278, 1117/1279, 1117/1252/1253, de manera particularmente preferida Y1117A/F1252Y, Y1117A/H1253K, Y1117A/1278H, Y1117A/G1279N, Y1117C/F1252Y, Y1117C/H1253K, Y1117C/L1278H, Y1117C/G1279N, Y1117V/F1252Y, Y1117V/H1253K, Y1117V/L1278H, Y1117V/G1279N, Y1117A/F1252Y/H1253K, Y1117C/F1252Y/H1253K e Y1117V/F1252/H1253K.

12. Composición, que contiene una proteína transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 11, y por lo menos una molécula que interviene, comprendiendo la molécula que interviene una molécula orgánica pequeña, un péptido

o una proteína.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que la molécula que interviene se une de manera covalente mediante un enlace de péptido, un enlace de éster, un enlace de éter, un enlace de sulfuro, un enlace de bisulfuro o un enlace carbono-carbono.

14. Composición según la reivindicación 12, en la que la molécula orgánica pequeña es un virustático, citostático, antibiótico o una inmunoglobina.

15. Composición según la reivindicación 12, en la que la proteína comprende una proteasa.

16. Composición según la reivindicación 15, en la que la proteasa comprende una proteína de neurotoxina de un 5 Clostridium botulinum del tipo A, B, C1, D, E, F y G.

17. Composición según la reivindicación 15, en la que la proteasa contiene un fragmento activo proteolíticamente, que es derivado de la proteína de Clostridium botulinum del tipo A, B, C1, D, E, F y G.

18. Composición según la reivindicación 17, caracterizada porque la proteasa contiene la secuencia His-Glu-Leu-Xaa-His- (Xaa) 33-35-Glu- (Xaa) 84-90-Glu- (Xaa) 11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr, pudiendo ser Xaa cualquier aminoácido, y separando la proteasa unos sustratos específicos dentro de la neurona motor colinérgica.

19. Composición según la reivindicación 18, en la que los sustratos son seleccionados de entre las proteínas, que

están involucradas en la liberación de los neurotransmisores en los nervios periféricos, y las proteínas que son aptas para producir reacciones catalíticas dentro de la neurona.

20. Composición según la reivindicación 19, en la que la proteasa y la proteína transportadora están enlazadas de

forma covalente por una secuencia de aminoácidos, que es reconocida y separada específicamente por una 20 endopeptidasa.

21. Composición según la reivindicación 20, en la que después de la separación mediante la endopeptidasa un puente de bisulfuro conecta la proteasa y la proteína transportadora entre sí, que, a su vez, produce la generación de una holotoxina activa.

22. Composición farmacéutica, que contiene la proteína transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 11 o la composición según una de las reivindicaciones 12 a 21, así como opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, un diluyente y/o un aditivo.

23. Composición farmacéutica según la reivindicación 22 para el tratamiento de una disfunción o enfermedad para la cual está indicada una terapia con neurotoxina Botulinus.

24. Composición farmacéutica según la reivindicación 23, en la que la disfunción o enfermedad es una de entre las

siguientes: espasmo hemifacial, tortícolis espasmódica, espasticidades, distonías, migraña, dolores, enfermedades 35 de la columna cervical o lumbar, estrabismo, hipersalivación y enfermedades depresivas.

25. Composición cosmética, que contiene la proteína transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 11 o la composición según una de las reivindicaciones 12 a 21, así como opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, un diluyente y/o un aditivo.

26. Uso de una composición cosmética según la reivindicación 25 como producto cosmético, en el que las indicaciones cosméticas son hiperhidrosis y arrugas faciales muy pronunciadas.

27. Procedimiento para la producción de una proteína transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 11 o de

45 una composición según una de las reivindicaciones 12 a 21 mediante recombinación según los procedimientos conocidos.

28. Célula huésped, que contiene un vector de expresión recombinante y el vector de expresión codifica una proteína

transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición según una de las reivindicaciones 12 a 50 33.

29. Célula huésped según la reivindicación 28, en la que la célula huésped puede ser una célula de Escherichia coli, Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris o Bacillus megaterium.

55 30. Vector de expresión, en el que el vector comprende un ácido nucleico, que codifica una proteína transportadora según una de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición según una de las reivindicaciones 12 a 21.