Una proteína quimérica que comprende diferentes fragmentos de los receptores de VEGF,

FLT-1 y KDR, caracterizada porque la proteína quimérica consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, los dominios 3º y 4º de tipo Ig de KDR y Fc de inmunoglobulina humana, designándose la proteína quimérica como FLTd2KDRd3, 4-Fc.

Proteína quimérica inhibidora de la angiogénesis y el uso Campo de la invención La presente invención se refiere a la tecnología de ingeniería genética, más específicamente a secuencias de ADN que codifican para proteínas quiméricas recombinantes inhibidoras de la angiogénesis, a las proteínas quiméricas codificadas del presente documento, a aplicaciones terapéuticas de las mismas y a composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas quiméricas.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes. La mayor parte del sistema vascular adulto es quiescente, sólo se produce angiogénesis en algunos mecanismos fisiológicos y patológicos, tales como tumor, retinopatías diabéticas, artritis, órganos anémicos, hiperplasia del endometrio, etc. La angiogénesis desempeña papeles clave en el crecimiento rápido de células tumorales durante el desarrollo tumoral (Hanahan y Folkman: Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell, 1996, 86:353-364) . Estudios de modelos de cáncer con animales y ensayos clínicos con seres humanos ya han demostrado que la inhibición de la angiogénesis tumoral pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento y el desarrollo tumorales, por tanto prolongar la vida del paciente. La angiogénesis está mediada y regulada por muchos factores biológicos. Las células principales que median la angiogénesis son células endoteliales vasculares que forman la pared interna de los vasos sanguíneos. Diversos factores de crecimiento pueden unirse a receptores relevantes en la superficie de las células endoteliales vasculares, regular procesos celulares a través de la transducción de señales intracelulares, y por tanto mediar la angiogénesis.

Entre diversos factores de crecimiento, VEGF (factor de crecimiento de células endoteliales vasculares) es el factor angiogénico más importante (Ferrara: VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor, Nat. Rev. Cancer, 2002, 10: 795-803; Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 supl.) : 10-14) . VEGF podría secretarse por muchos tipos de células, pero a menudo se sobreexpresa en células tumorales. VEGF funciona mediante la unión a a receptores apropiados. Existen principalmente dos tipos de receptores de VEGF: FLT-1 (tirosina cinasa de tipo fms) y KDR. En cuanto a las estructuras moleculares, estos dos receptores consisten ambos en tres regiones funcionales diferentes: la primera región es la región extracelular, que consiste en siete dominios de tipo inmunoglobulina (de tipo Ig) (d1d7) , que tiene afinidad específica por VEGF, y es la región clave para la unión a VEGF; la segunda región es la región transmembrana que contiene residuos de aminoácidos hidrófobos; la tercera región es el dominio intracelular que contiene un grupo con funcionamiento de tirosina quinasa, que se fosforila después de que se activa el receptor por VEGF, desencadenando la transducción de señales intracelulares, que conduce a efectos funcionales de células endoteliales y angiogénesis.

FLT-1 y KDR se distribuyen principalmente en las células endoteliales vasculares. Por tanto, la actividad mediadora de VEGF en células endoteliales vasculares es altamente específica. VEGF promueve diferenciaciones de células endoteliales, guía las migraciones de células endoteliales, inhibe la apoptosis, induce cambios morfológicos vasculares, y es un factor proangiogénico altamente eficaz.

El nivel de expresión de VEGF en tejidos tumorales es superior a aquél en los tejidos normales. Además, el crecimiento rápido de células tumorales conduce a menudo a hipoxia dentro del tumor, y la hipoxia induce además la expresión de VEGF. Por tanto, VEGF es el factor clave que promueve la angiogénesis tumoral. Muchos estudios con animales han mostrado que inhibiendo la unión a VEGF a sus receptores pudo inhibirse de manera eficaz la angiogénesis tumoral, y por tanto inhibir el crecimiento tumoral. En otras enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tales como retinopatías diabéticas y artritis, etc., VEGF también está implicado estrechamente en el desarrollo de estas enfermedades (Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications. Semin. Oncol. 2002, 29 (6 supl.) : 10-14) .

Debido a los papeles críticos de VEGF en cánceres y otras enfermedades, las proteínas o químicos que inhiben específicamente VEGF tienen potenciales terapéuticos. Por ejemplo, estudios han mostrado que el anticuerpo neutralizante contra VEGF pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento tumoral (Jain: Tumor angiogenesis and accessibility: role of vascular endothelial growth factor, Semin. Oncol., 2002, 29 (6 supl.) : 3-9) . Por tanto, el desarrollo de inhibidores de VEGF eficaces novedosos es importante en investigación clínica. Puesto que FLT-1 y KDR son elementos de unión naturales de VEGF, hubo estudios que investigaron los papeles antiangiogénicos del FLT-1 soluble (el dominio extracelular de FLT-1) y el KDR soluble (el dominio extracelular de KDR) (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002: 2019-2023) . El FLT-1 soluble pudo inhibir de manera eficaz el crecimiento de células endoteliales vasculares in vitro, pero tiene una corta semivida sérica y no puede alcanzar una concentración sérica eficaz. De manera similar, el KDR soluble también pudo inhibir el crecimiento de células endoteliales vasculares in vitro, pero su actividad antitumoral en modelos con animales no fue satisfactoria (Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002: 2019-2023) .

La patente estadounidense n.º 6.100.071 da a conocer proteínas receptoras de VEGF quiméricas que comprenden secuencias derivadas de los receptores flt-1 y KDR. La publicación de patente internacional n.º WO 00/75319 da a conocer polipéptidos quiméricos modificados del receptor Flt-1. Shinkai et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273 (47) , págs. 31283-31288) dan a conocer mutantes de deleción del receptor KDR y examinan las afinidades de unión de estos mutantes para VEGF. Ninguno de estos documentos da a conocer proteínas quiméricas tal como se reivindica actualmente.

Para superar las deficiencias de la técnica anterior, la presente invención proporciona proteínas quiméricas novedosas que contienen diferentes fragmentos de FLT-1 y KDR para bloquear de manera eficaz la actividad biológica de VEGF e inhibir la angiogénesis.

Sumario de invención

La invención proporciona proteínas quiméricas recombinantes novedosas que bloquean la actividad biológica de VEGF e inhiben la angiogénesis, secuencias de ADN que codifican para las proteínas quiméricas mencionadas anteriormente, y vectores que contienen las secuencias de ADN codificantes de las proteínas quiméricas y huéspedes recombinantes de los mismos, tal como se reivindica en el presente documento.

La invención también proporciona el uso de las proteínas quiméricas en la preparación de medicamentos que bloquean la actividad de VEGF e inhiben la angiogénesis, y composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas quiméricas y vehículos médicos apropiados, así como aplicaciones terapéuticas de la composición médica, tal como se reivindica en el presente documento.

Los puntos clave de la invención son diseñar y construir una serie de proteínas quiméricas con diferentes fragmentos de FLT-1 o KDR, que contienen Fc de inmunoglobulina humana (en la figura 1 se muestra el método de construcción preferido) , y entonces seleccionar la proteína quimérica con alta afinidad para VEGF usando ensayos incluyendo el ensayo de unión a VEGF, y finalmente obtener el inhibidor de VEGF apropiado. La construcción de la proteína quimérica se basa preferiblemente en las tecnologías de clonación molecular convencionales. Podría encontrarse la metodología experimental detallada en manuales de laboratorio tales como Molecular Cloning, la 2ª o la 3ª edición (Joseph Sambrook) .

Las proteínas quiméricas que pueden prepararse a través de tecnología de ADN recombinante para contener diferentes fragmentos de los receptores de VEGF, FLT-1 y KDR, incluyen los siguientes grupos:

a. Que consiste en el 1er dominio de tipo Ig de KDR, el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1 y el 3er dominio de tipo Ig de KDR, designado como KDRd1-FLTd2-KDRd3;... [Seguir leyendo]

1. Una proteína quimérica que comprende diferentes fragmentos de los receptores de VEGF, FLT-1 y KDR, caracterizada porque la proteína quimérica consiste en el 2º dominio de tipo Ig de FLT-1, los dominios 3º y 4º de tipo Ig de KDR y Fc de inmunoglobulina humana, designándose la proteína quimérica como FLTd2KDRd3, 4-Fc.

2. La proteína quimérica según la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos es como se muestra en SEQ ID NO: 7.

3. ADN recombinante que codifica para la proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. El ADN recombinante según la reivindicación 3 que codifica para la proteína quimérica según la reivindicación 2, en donde la secuencia de ADN es como se muestra en SEQ ID NO: 6.

5. Un vector que comprende las secuencias de ADN recombinante según las reivindicaciones 3 ó 4, donde el vector es seleccionado de un plásmido, un virus o un fragmento de ADN.

6. Un huésped recombinante que contiene el vector recombinante según la reivindicación 5, en donde las células huésped son células eucariotas o células procariotas.

7. Una composición farmacéutica la cual comprende una proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que la composición farmacéutica es una disolución inyectable.

9. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 7 o la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyendo tumor, retinopatías diabéticas, artritis, anemia o hiperplasia del endometrio.

10. El uso de una proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento antiangiogénico.

11. El uso según la reivindicación 10 en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyendo tumor, retinopatías diabéticas, artritis, anemia o hiperplasia del endometrio.

12. La proteína quimérica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento antiangiogénico.

13. La proteína quimérica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyendo tumor, retinopatías diabéticas, artritis, anemia o hiperplasia del endometrio.