Proteína de fusión de la hormona del crecimiento.

Una proteína de fusión que comprende una fusión traduccional en fase de:

i) un dominio de unión modificado de hormona de crecimiento en el que dicha modificación es la sustitución del residuo aminoacídico glicina 120 de la Figura 12 por arginina o lisina; y

ii) una parte del receptor de hormona de crecimiento [GHR] que comprende el dominio SD-100 C-terminal de GHR.

Proteína de fusión de la hormona del crecimiento.

La invención se refiere a polipéptidos quiméricos en los que dichos polipéptidos comprenden un dominio de unión modificado de hormona de crecimiento ligado con un dominio de unión receptor del receptor de hormona de crecimiento.

La GH es un miembro de una gran familia de hormonas implicadas en la regulación del crecimiento y desarrollo de mamíferos. La GH humana es un polipéptido de 22 kDa que está implicado en una serie de procesos biológicos. Por ejemplo, crecimiento celular, lactación, activación de macrófagos y regulación del metabolismo energético. La GH interactúa secuencialmente con dos GHR unidos a membrana mediante dos sitios separados en GH designados como sitio 1 y sitio 2. El sitio 1 es un sitio de alta afinidad y el sitio 2 es un sitio de baja afinidad. Una sola molécula de GH se une a un GHR mediante el sitio 1. Se incorpora entonces un segundo GHR mediante el sitio 2, formando un complejo GHR:GH:GHR. Se internaliza entonces el complejo y activa una cascada de transducción de señal que conduce a cambios en la expresión génica.

El dominio extracelular de GHR existe en forma de dos dominios ligados cada uno de aproximadamente 100 aminoácidos (SD-100) , estando el dominio SD-100 C-terminal (b) más cercano a la superficie celular y el dominio SD100 N-terminal (a) más lejano. Es un cambio conformacional en estos dos dominios lo que ocurre en la unión de hormona, con la formación del complejo trimérico GHR-GH-GHR.

Se dan a conocer GH modificadas en el documento US 5.849.535, que se incorpora como referencia. La modificación de GH es en ambos sitios de unión, sitio 1 y sitio 2. Las modificaciones del sitio 1 producen una molécula de GH que tiene una mayor afinidad por GHR en comparación con la GH de tipo silvestre. Estas moléculas de GH modificadas actúan como agonistas. Se han dado a conocer también modificaciones del sitio 2 que dan como resultado la creación de antagonistas de GH. Se dan a conocer ejemplos adicionales de modificaciones en GH que alteran la afinidad de unión de GH por el sitio 1 en los documentos US 5.854.026, US 6.004.931, US 6.022.711, US 6.057.292 y US 6.136.563, cada uno de los cuales se incorpora como referencia. Se proporciona en la Tabla 1 un sumario de las modificaciones realizadas al sitio 1. Las modificaciones del sitio 2 se dan a conocer también, en particular el residuo aminoacídico G120 que, cuando se modifica a arginina, lisina, triptófano, tirosina, fenilalanina o ácido glutámico, crea una molécula de GH con propiedades antagonistas.

Además, la GH modificada se recubre con polietilenglicol (PEG) mediante un proceso conocido como "pegilación", y esto tiene varios efectos beneficiosos. En primer lugar, el recubrimiento con PEG aumenta el peso molecular eficaz de la GH de 22 kDa a aproximadamente 40 kDa. El efecto que esto tiene es reducir la filtración glomerular de la GH, aumentando así la semivida de la GH in vivo, lo que reduce la dosis administrada para producir el efecto deseado. Además, se cree que la pegilación reduce tanto la inmunogenicidad como la toxicidad de las proteínas que se tratan de esta manera, véase Abuchowski et al. J. Biol. Chem., 252, 3578-3581, (1977) .

Sin embargo, es una consecuencia de la pegilación la reducción de la afinidad de la molécula de GH modificada por GHR. Esto significa que se requiere una dosis aumentada para dar cuenta de la afinidad reducida. Esto es indeseable, puesto que contrarresta el efecto ventajoso de la pegilación con respecto a aumentar la semivida de la GH modificada. Sería deseable proporcionar una molécula de GH modificada que no requiriera pegilación pero que tuviera una semivida aumentada y también tuviera los beneficios añadidos de una inmunogenicidad reducida y carencia de toxicidad.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una proteína de fusión como se define en las reivindicaciones.

Como se describe anteriormente, son conocidas en la materia mutaciones del sitio 1 que aumentan la afinidad de la hormona de crecimiento por su dominio de unión en receptor de hormona de crecimiento. Dicha hormona de crecimiento modificada actúa como agonista. Si se combina una modificación de sitio 1 con una modificación de sitio 2, en la que la última modificación da como resultado un sitio de unión de sitio 2 inactivo o parcialmente activo, entonces dicha molécula es un antagonista. Una modificación solo en el sitio 2 que explote un sitio de unión de sitio 1 de tipo silvestre crea también un antagonista.

Según la invención, dicha modificación del sitio 2 es en el residuo aminoacídico 120 de la secuencia presentada en la Figura 13. Preferiblemente, dicha modificación del sitio 2 se combina con modificaciones del sitio 1 como se dan a conocer en la presente memoria. Como alternativa, la GH se modifica solo en el residuo aminoacídico glicina 120.

Preferiblemente, dicha sustitución es arginina o lisina.

En una realización preferida adicional de la invención, el dominio de unión a hormona de crecimiento de GHR es el dominio extracelular de GHR. Más preferiblemente, el dominio de unión es el dominio SD-100 C-terminal de GHR.

En una realización preferida de la invención, dicho polipéptido quimérico es una proteína de fusión en la que la GH modificada está en una fusión traduccional en fase con GHR, o parte del mismo. Preferiblemente, dicho polipéptido de fusión comprende GH modificada y el dominio SD-100 C-terminal de GHR.

En una realización alternativa preferida adicional de la invención, el dominio de unión modificado de GH está ligado por un ligador con el dominio de unión a GH de GHR. El ligador puede ser flexible.

El ligador podría estar en cualquier residuo dentro del dominio extracelular del receptor, lo que permitiría a la GH modificada unirse flexiblemente con el receptor libre en la superficie celular. Preferiblemente, se realiza el ligamiento entre un residuo cercano al extremo C de la molécula de GH modificada y un residuo cercano al extremo N de GHR. Más preferiblemente, se realiza el ligamiento entre un residuo cercano al extremo C de la molécula de GH modificada y un residuo cercano al extremo N del SD-100 C-terminal. Más preferiblemente, el ligamiento se realiza en cualquiera de los residuos 126-128 del extremo N del SD-100 C-terminal de GHR. En una realización de la invención, el ligamiento se realiza en el residuo 127 del extremo N del SD-100 C-terminal. Preferiblemente, el ligador es un péptido.

La estructura cristalina del complejo GHR:GH:GHR revela que la distancia entre el extremo C de GH (residuo 191) y elextremo N del SD-100 C-terminal (residuos 126-128) es de 10 Ã. Esto proporciona información inestimable con respecto al diseño de ligador.

Preferiblemente, el ligador es un polipéptido que comprende de 5 a 30 residuos aminoacídicos. Más preferiblemente, el ligador comprende de 10 a 20 residuos aminoacídicos. Más preferiblemente aún, el ligador comprende al menos una copia del péptido:

Gly Gly Gly Gly Ser (designado en adelante como "Gly4Ser") .

En una realización de la invención, el ligador es de 10 aminoácidos de longitud y comprende dos copias del ligador Gly4Ser. En una realización alternativa de la invención, el ligador es de 15 aminoácidos de longitud y comprende tres copias del ligador Gly4Ser. En aún otra realización alternativa, el ligador es de 20 aminoácidos de longitud y comprende cuatro copias del ligador Gly4Ser.

En una realización preferida de la invención, dicho polipéptido deriva de GH humana y GHR humano.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido según la invención.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican una hormona de crecimiento modificada según la invención pueden sintetizarse típicamente mediante técnicas moleculares conocidas en la materia que incluyen métodos recombinantes, así como la síntesis de moléculas de ácido nucleico usando sintetizadores oligonucleotídicos.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la invención.

En una realización preferida de la invención, dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresión génica recombinante.

Típicamente, dicha adaptación incluye, por ejemplo y no a modo de limitación, la provisión... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión que comprende una fusión traduccional en fase de:

i) un dominio de unión modificado de hormona de crecimiento en el que dicha modificación es la sustitución del residuo aminoacídico glicina 120 de la Figura 12 por arginina o lisina; y ii) una parte del receptor de hormona de crecimiento [GHR] que comprende el dominio SD-100 C-terminal de GHR.

2. Una proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que dicha sustitución es de glicina 120 por arginina.

3. Una proteína de fusión según la reivindicación 1 o 2, en la que la parte del receptor de hormona de crecimiento (GHR) es el dominio extracelular de GHR.

4. Una proteína de fusión según las reivindicaciones 1-3, en la que el dominio de unión modificado de GH está ligado por un ligador con el dominio de unión a GH de GHR.

5. Una proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que el ligador es un polipéptido que comprende de 5 a 30 residuos aminoacídicos.

6. Una proteína de fusión según la reivindicación 5, en la que el ligador comprende de 10 a 20 residuos aminoacídicos.

7. Una proteína de fusión según la reivindicación 4 o 5, en la que el ligador comprende al menos una copia del péptido Gly Gly Gly Gly Ser.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Un vector según la reivindicación 9, en el que dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresión recombinante.

11. Una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso como producto farmacéutico.

12. Una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo consistente en gigantismo, acromegalia, cáncer, tumor de Wilm, sarcoma osteogénico, de mama, colon, próstata, tiroides, retinopatía diabética, nefropatía diabética, complicaciones diabéticas y cualquier enfermedad por exceso de GH.

13. Una proteína de fusión según la reivindicación 12 para uso en el tratamiento de acromegalia.

14. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

15. Una célula transformada o transfectada con el ácido nucleico o vector según cualquiera de las reivindicaciones 8-10.

16. Una célula según la reivindicación 15, en la que dicha célula es una célula eucariótica seleccionada del grupo consistente en: un moho mucilaginoso, Dictyostelium spp, una célula de levadura, Saccharomyces cerevisae, Pichia spp; una célula de mamífero, ovario de hámster chino; una célula de planta; una célula de insecto, Spodoptera spp.

17. Una célula según la reivindicación 15, en la que dicha célula es una célula procariótica.

18. Un método de fabricación de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende i) proporcionar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, ii) incubar dicha célula en condiciones que conduzcan a la producción de dicha proteína de fusión; y

opcionalmente iii) aislar la proteína de fusión a partir de la célula o el medio de cultivo celular.

19. Un método según la reivindicación 18, en el que dicha proteína de fusión está dotada de una señal de secreción para facilitar la purificación de la proteína de fusión a partir de dicha célula.

20. Un método según la reivindicación 19, en el que dicha proteína de fusión está dotada de un marcaje de afinidad para facilitar la purificación de la proteína de fusión a partir de dicha célula o el medio de cultivo celular.

21. Una proteína de fusión según la reivindicación 1, que comprende una fusión traduccional en fase de:

i) una hormona de crecimiento modificada en la que dicha modificación es una sustitución de: histidina 18 con ácido aspártico, de histidina 21 con asparagina, de glicina 120 con arginina, de arginina 167 con asparagina, de lisina 168 con alanina, de ácido aspártico 171 con serina, de lisina 172 con arginina, de ácido glutámico 174 con serina y de isoleucina 179 con treonina; y ii) una parte del receptor de hormona de crecimiento [GHR] que comprende el dominio SD100 C-terminal de GHR.

Figura 1 Figura 2 Figura 3

Figura 4

Figura 5 Figura 6

Figura 7

Figura 8 Figura 9 Figura 10

Figura 11

Figura 12 Figura 13