Un proceso para producir una composición de antitrombina III humana recombinante que comprende moléculasde antitrombina III humana recombinante que tiene cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo,

en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa noestá unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas,

que comprende cultivar, en un medio, un transformante obtenido introduciendo, en una célula CHO derivada de untejido de ovario de hámster chino, un ADN que codifica la antitrombina III en el que el genoma se modifica para teneruna actividad delecionada de una enzima relacionada con la síntesis de la GDP-fucosa, o una enzima relacionadacon la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosaminaen el extremo reductor a través de un enlace a en una cadena glucídica unida a N-glucósido detipo complejo para formar y acumular, en el cultivo, dicha antitrombina III; y recuperar del cultivo dicha composiciónde antitrombina III.

Proceso para producir una composición de antitrombina III

Campo técnico

La presente invención se refiere a un proceso para producir una composición de antitrombina III que comprende una molécula de antitrombina III que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas.

Antecedentes de la técnica

La formación de un trombo viene acompañada del riesgo de detener el flujo sanguíneo. Dado que la interrupción del flujo sanguíneo por la formación de trombos se convierte en un factor letal, el organismo tiene diversos mecanismos para controlar y regular la coagulación sanguínea. Esto es, la inactivación directa de factores de coagulación activados por serina proteasa [The Thrombin; Volumen I (Machovich R., ed.) , páginas 1-21, CRC Press, Boca Ratón (1982.) ], un mecanismo regulador basado en la degradación del factor V y factor VIII por la proteína C activada [Progress in Hemostasis and Thrombosis, Volumen 7 (Spaet T. H., ed.) , páginas 25-54, Grune & Stratton, Nueva York (1984) ] y un mecanismo inhibidor de factores de coagulación activados por diversos inhibidores de serina proteasa en sangre. Además, también se ha encontrado la presencia de un inhibidor del factor tisular que inhibe la activación del factor VII de una manera dependiente del factor X activado [Journal of Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis, 2, 550. (1991) ]. El mecanismo más importante entre estos es el mecanismo inhibidor de factores de coagulación activados por diversos inhibidores de serina proteasa en sangre.

En la sangre están presentes diversos inhibidores de serina proteasa, y su cantidad alcanza el 10% de la proteína plasmática total. Se sabe que, entre estos inhibidores, 4 inhibidores, en concreto la antitrombina III, un inhibidor de proteinasa, e2 macroglobulina y cofactor II de heparina son importantes en la regulación de la coagulación sanguínea. Entre tales inhibidores, la antitrombina III es particularmente importante y ocupa el 70% de la actividad de la antitrombina en plasma.

La antitrombina III es una glucoproteína que comprende 432 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 59.000 a 65.000 y en su molécula tiene tres enlaces disulfuro, Cys8-Cys128, Cys21-Cys95 y Cys247-Cys430 [Proc. Natl. Acad Sci, USA, 80, 1845 (1983) ]. Mediante estos enlaces, en el extremo C se forma una gran estructura en bucle, y como centro activo en esta estructura en bucle existe un enlace Arg393-Ser394 (Fig. 1) . La antitrombina III humana tiene un punto isoeléctrico de 5, 11. Las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido se añaden a 4 posiciones, contando los restos 96, 135, 155 y 192 de asparagina desde el extremo N (en lo sucesivo en el presente documento denominados Asn96, Asn135, Asn155 y Asn192, respectivamente) de la antitrombina III. La antitrombina III en plasma humano existe en dos tipos de isoformas, un tipo e que tiene cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido y un tipo 1 que solo tiene tres cadenas glucídicas unidas a N-glucósido pero no tiene una cadena glucídica en la posición Asn135 [Pathophysiol. Haemost. Thromb., 32, 143 (2002) ] y en la antitrombina III en plasma humano, del 90 al 95% es del tipo e y el restante 5 al 10% es del tipo 1.

Las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo añadidas a la antitrombina III están constituidas por N-acetilglucosamina, ácido siálico, galactosa y manosa (Fig. 2) . Una de las características de la distribución de la antitrombina III en el plasma humano es que la estructura de cadena glucídica es libre a partir de la modificación de fucosa.

La antitrombina III se ha desarrollado como un inhibidor de la coagulación sanguínea y, a nivel mundial, se usa ampliamente para el tratamiento de la trombosis en base al síndrome congénito del déficit de antitrombina III y de coagulación sanguínea intravascular múltiple que viene acompañado por una disminución de antitrombina III.

Usando, como materia prima, muestras de plasma humano agrupado, se producen preparaciones sanguíneas tales como antitrombina III. En Japón, el plasma agrupado se prepara en el Plasma Fractionation Center, Japanese Red Cross Society, mezclando muestras de plasma de aproximadamente 5.000 a 10.000 voluntarios y después de concluir los 6 meses de almacenaje se suministran. En realidad, para producir un lote de una preparación de sangre, tal como una preparación concentrada, deshidratada, del factor VIII humano de coagulación sanguínea, Cross Eight M (Japanese Red Cross Society) , se necesitan varios lotes de crioprecipitados obtenidos de las muestras de plasma agrupado descritas anteriormente, y se usan aproximadamente muestras de plasma de aproximadamente 80.000 voluntarios [Japanese Journal of Transfusion Medicine, 48, 27 (2002) ].

El plasma agrupado se produce usando, como materia prima, muestras de sangre proporcionadas por donantes de sangre, y se ha informado que, en Japón, la proporción de resultados positivos al parvovirus humano B19 en donantes de sangre se calcula que es del 0, 6 al 0, 8% [Journal of Japan Society of Blood Transfusion, 42, 231 (1996) ]. Por tanto, se calcula que un lote equivalente al Cross Eight M, descrito anteriormente, está contaminado con muestras de sangre positivas a parvovirus humano B19 que, a grosso modo, corresponden a de 480 a 640 donantes. El parvovirus humano B19 es un virus pequeño de 18 a 26 nm de diámetro sin envuelta y mantiene su resistencia incluso después de realizar tratamiento térmico a 60 ºC durante 30 minutos, tratamiento ácido a un pH de aproximadamente 3, tratamiento con cloroformo, tratamiento con tensioactivos y similares [Science, 262, 114 (1993) ], de manera que no puede eliminarse por procedimientos de eliminación de virus generales. Por consiguiente, la eliminación del parvovirus humano B19 requiere una etapa de filtración a través de una membrana exclusivamente desarrollada para la eliminación del virus que tiene un tamaño de poro de varios nanómetros a varias decenas de nanómetros. Sin embargo, se considera que una etapa de filtración, concretamente una etapa de nanofiltración , que usa un tamaño de poro de membrana pequeño de este tipo, es difícil de introducir en los procesos de producción de muchas preparaciones de fraccionamiento de plasma [Japanese Journal of Transfusion Medicine, 48, 27 (2002) ]. Se considera que el parvovirus humano B19 es la causa de eritema infeccioso y generalmente solo muestra síntomas gripales transitorios en el caso de personas sanas sin anticuerpos anti-B19, lo que causa anemia hemolítica crónica en algunos casos. Además, se dice que algunas veces esto induce a aplasia eritrocitaria pura aguda grave en pacientes inmunodeficientes. Además, existe un informe que afirma que en las gestantes que no tienen anticuerpos anti-B19 algunas veces se produce edema que causa aborto o bebés nonatos, y el 15% de la muerte fetal intrauterina fue positiva con respecto al resultado de un examen de ADN del B19 [Lancet, 357, 1494 (2001) ]. En la preparación concentrada, deshidratada, del factor VIII humano de coagulación sanguínea, Cross Eight M (Japanese Red Cross Society) , en septiembre de 1997, se informo de un caso en el que se sospechó de una infección transitoria con parvovirus humano B19 por la administración de esta preparación [Journal of Japanese Society of Child Hematology, 11, 289 (1997) ].

Como materia para la producción de preparaciones de sangre de antitrombina III, tales como Neuart (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation) y antitrombina P (fabricada por Aventis Boehring) , se usó plasma agrupado negativo al virus de la hepatitis B, negativo al virus de la hepatitis C y negativo al virus I y II de la inmunodeficiencia humana, pero no se confirmo la presencia o ausencia del parvovirus humano B19 en la materia prima.

Aunque en el proceso de producción de preparaciones de sangre de antitrombina III se realizó un tratamiento de inactivación de virus a 60 ºC durante 10 horas, concretamente pasteurización, existieron problemas tales como que, al ser la antitrombina III una proteína, esta se desnaturaliza y que el virus del SIDA, parvovirus y prión humanos que se convirtieron en la causa de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob de tipo mutación no pudieron eliminarse completamente.

Como se ha descrito anteriormente, el uso de preparaciones de sangre tiene desventajas ya que existe un riesgo de infección viral, y las técnicas actuales... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir una composición de antitrombina III humana recombinante que comprende moléculas de antitrombina III humana recombinante que tiene cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas, que comprende cultivar, en un medio, un transformante obtenido introduciendo, en una célula CHO derivada de un tejido de ovario de hámster chino, un ADN que codifica la antitrombina III en el que el genoma se modifica para tener una actividad delecionada de una enzima relacionada con la síntesis de la GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace e en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo para formar y acumular, en el cultivo, dicha antitrombina III; y recuperar del cultivo dicha composición de antitrombina III.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo son cadenas glucídicas que se unen a cuatro restos asparagina en las posiciones 96, 135, 155 y 192 respectivamente, en la secuencia de aminoácidos de la molécula antitrombina III humana.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que se han inactivado todos los alelos sobre el genoma que codifica la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, la GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace e en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo.

4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima relacionada con la síntesis de la GDP-fucosa es una enzima seleccionada del grupo que consiste en GDP-manosa 4, 6-deshidratasa (GMD) y GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa (Fx) .

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que la GDP-manosa 4, 6-deshidratasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7.

6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que la GDP-manosa 4, 6-deshidratasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 9.

8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10.

9. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace e en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo es una e1, 6-fucosiltransferasa.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la e1, 6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11.

11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la e1, 6-fucosiltransferasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 13.

12. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el transformante es FERM BP08472, FERM BP-10083 o FERM BP-10088.

13. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la antitrombina III es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde las posiciones 33 a 464 de la SEC ID Nº: 4.

14. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la antitrombina III es un polipéptido codificado por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde las posiciones 97 a 1392 de la SEC ID Nº: 1.

15. Una composición de antitrombina III que se obtiene mediante el proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Un medicamento que comprende, como ingrediente activo, la composición de antitrombina III de acuerdo con la

reivindicación 15.

17. El medicamento de acuerdo con la reivindicación 16, que es un agente para el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedades acompañadas con coagulación sanguínea.