Proceso para producir lactoperoxidasa.

Un proceso para producir lactoperoxidasa, que comprende:

- una etapa (1) para poner en contacto uno o más materiales lácteos con un intercambiador de cationes que tienegrupos débilmente ácidos como grupos de intercambio de iones para efectuar así un tratamiento de adsorción;

- una etapa (2) para lavar el intercambiador de cationes después de dicho tratamiento de adsorción;

- una etapa (3) para poner dicho intercambiador de cationes lavado en contacto con un disolvente de lixiviación quetiene una resistencia iónica de 0,07 a 0,3 y eluye lactoperoxidasa para obtener así una solución de lixiviación quetiene lactoperoxidasa eluida en dicho eluyente de lixiviación;

- una etapa (4) para concentrar dicha solución de lixiviación a través de una membrana de ultrafiltración de formaque el contenido de proteínas en dicha solución de lixiviación concentrada resulta ser de 0,9 a 15%, para efectuarasí la precipitación de proteínas como impurezas en la solución de lixiviación concentrada; y

- una etapa (5) para obtener una solución de lactoperoxidasa separando la precipitación de proteínas comoimpurezas a partir de dicha solución de lixiviación concentrada.

Proceso para producir lactoperoxidasa

Campo técnico La presente invención se refiere a un proceso para producir lactoperoxidasa de pureza elevada a partir de materiales lácteos. Se reivindica prioridad de la solicitud de patente japonesa nº 2004-039704, presentada el 17 de febrero de 2004.

Técnica antecedente La lactoperoxidasa es una oxidorreductasa contenida en leche de mamíferos como la leche de vaca y otras secreciones como la saliva, fluido lacrimal y mucosidad del tracto respiratorio (por ejemplo, American Journal of Respirator y and Critical Care Medicine, EE.UU., vol. 166, 2002, p. S57 a S61) . La lactoperoxidasa es una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 80.000. La lactoperoxidasa tiene heme como una coenzima por una molécula. Como la longitud de onda de absorción máxima de esta heme es de aproximadamente 412 nm, la lactoperoxidasa altamente purificada exhibe un color marrón (por ejemplo, British Journal of Nutrition, Inglaterra, vol. 84, 2000, p. S19 a S25) .

Está descrito que la lactoperoxidasa tiene diversas funciones biológicas como propiedades antibacterianas, actividad antiviral, actividad antioxidativa, actividad anticancerígena y actividad inmunorreguladora (por ejemplo, dicho British Journal of Nutrition, Inglaterra, vol. 84, 2000, p. S19 a S25, y Life Sciences, Inglaterra, vol. 43, 1988, p. 739 a 745) , y se ha puesto de manifiesto que esta es una proteína muy importante en relación con la defensa del hospedantes. En relación a la aplicación industrial de esta lactoperoxidasa, se han descrito técnicas tales como: uso de lactoperoxidasa, donante de peróxido y tiocianato para la fabricación de un medicamente para tratar una infección de helicobacter pylori (por ejemplo, traducción japonesa publicada nº 2000-509367 de PCT) ; un agente preventivo y terapéutico para una enfermedad infecciosa con gérmenes patógenos añadidos a la alimentación formulada para animales acuáticos cultivados (por ejemplo, patente japonesa nº 3103615) ; un agente para prevenir el envejecimiento (por ejemplo patente japonesa nº 3103167) ; un agente mejorador de la función hepática (por ejemplo, solicitud de patente japonesa sin examinar, primera publicación, nº 2001-226289) , aplicaciones profilácticas y terapéuticas de peroxidasas (por ejemplo, traducción japonesa publicada nº H06-501453 de PCT) y un agente terapéutico para un trastorno corneal (por ejemplo, patente japonesa nº 2840795) . Además, se han descrito técnicas por los presentes inventores como para: una composición inactivante de ureasa y una bebida (por ejemplo, solicitud de patente japonesa sin examinar, primera publicación, nº 2002-238554) y un agente mejorador de la flora intestinal y alimento y bebida (por ejemplo, solicitud de patente japonesa sin examinar, primera publicación, nº 2003-246753) .

Se describen métodos de purificación para lactoperoxidasa a escala de laboratorio en: Acta Chemica Scandinavica, Dinamarca, vol. 23, 1969, p. 171 a 184; FEBS Letters, Holanda, vol. 110, 1980, p. 200 a 204; y Journal of Chromatography, Holanda, vol. 795, 1998, p. 277 a 287.

Como un método típico para ello, es conocido un método para: añadir un ácido como ácido clorhídrico a la leche, para precipitar isoeléctricamente caseína, con el fin de preparar suero lácteo que sirve como una materia sobrenadante; poner en contacto el suelo lácteo obtenido con un intercambiador de cationes, con el fin de adsorber la lactoperoxidasa con carga positiva en el suero lácteo en el intercambiador de cationes y, a continuación, lavar el intercambiador de cationes con una solución tamponante con bajo contenido de sal y seguidamente de sorber la lactoperoxidasa con una solución tamponante con elevado contenido de sal.

En un método de purificación a escala de laboratorio, con el fin de mejorar la pureza de la lactoperoxidasa, se usa generalmente un método para usar una columna que está rellena de forma muy densa con un intercambiador de cationes en forma de gel que tiene partículas de diámetro pequeño y el paso a velocidad elevada a través de la misma se realiza con una bomba a presión elevada (por ejemplo, Journal of Chromatography, Holanda, vol. 795, 1998, p. 277 a 287) .

Por otra parte, si una columna se rellena con un intercambiador de cationes que tenga partículas de diámetro relativamente grande y el paso a través se realiza por medio de un goteo natural sin una bomba a presión elevada, requiere más tiempo (por ejemplo, Acta Chemica Scandinavica, Dinamarca, vol. 23, 1969, p. 171 a 184 y FEBS Letters, Holanda, vol. 110, 1980, p. 200 a 204) .

Junto con el reciente progreso en técnicas de aislamiento a escala industrial, resulta posible aislar y purificar una sustancia bioactiva de pureza elevada contenida en la leche, para una producción en masa. En la mayoría de los casos, es realmente difícil realizar a escala un método de purificación de proteínas optimizado a escala de laboratorio y llevarlo a una escala industrial como tal. Una de las causas principales es que las características de propiedades de un intercambiador de cationes o una columna generalmente usados en un laboratorio no son necesariamente adecuadas para un tratamiento en masa de una materia prima.

Además, como la adición de aditivos a los materiales lácteos tiende a cambiar el sabor y las propiedades físicas de

la leche, no es preferible usar aditivos para purificar una proteína a partir de materiales lácteos. Además, si se usa una gran cantidad de aditivos con el fin de lavar un intercambiador de cationes y/o para desorber una proteína del intercambiador de cationes, resulta necesario separar estos aditivos a partir de la proteína purificada y se hace complicado el proceso de producción.

Como un proceso de producción para resolver estos problemas en la producción en una proteína de pureza elevada a partir de materiales lácteos, ya se ha propuesto por el presente solicitante un proceso de producción para lactoferrina bovina de pureza elevada 8por ejemplo, solicitud de patente japonesa examinada, segunda publicación, nº H06-13560) .

En lo que se refiere al proceso de protección industrial para lactoperoxidasa, se ha descrito lo que sigue.

En la memoria descriptiva de la patente de EE.UU. nº 4667018, se describe un proceso para purificar proteínas como lactoferrina y lactoperoxidasa a partir de leche o su derivado lácteo. En este proceso se describe un método parado. Poner en contacto la leche o su derivado lácteo con un intercambiador de cationes que comprende polisacáridos catiónicos; lavar el intercambiador de cationes con una solución con bajo contenido de sales y seguidamente desorber las proteínas del intercambiador de cationes con una solución de elevado contenido de sales. Sin embargo, como las proteínas producidas en el método descrito en este documento de patente son obtenidas en forma de una mezcla, la pureza no es elevada y hay un problema en cuanto no puede ser producida lactoperoxidasa de pureza elevada.

En la patente japonesa nº 2985158 se describe un método para recuperar una fracción de lactenina que tiene una pureza elevada. En este método descrito en este documento de patente, como la lactoperoxidasa es obtenida como un componente que constituye lactenina y contenido en una mezcla de proteínas, hay también un problema en cuanto no puede ser producida lactoperoxidasa de pureza elevada.

En la memoria descriptiva de la patente europea nº 0518448, como método para aislar proteínas a partir de la leche, se describe un método para usar un portador de quelato metálico. En este método, como la proteína aislada es una mezcla que comprende inmunoglobulina, lactoferrina y lactoperoxidasa, hay un problema en cuanto es imposible producir lactoperoxidasa de pureza elevada.

En la patente japonesa nº 3403066, se describe un método para recuperar un factor de proliferación celular o una composición que contiene uno o más tipos de factores de proliferación celular a partir de leche o un derivado lácteo. Sin embargo, como la composición obtenida en este método es una mezcla, hay también un problema en cuanto no es un proceso para producir lactoperoxidasa de pureza elevada.

En la patente Japonesa nº 2710283, como método para extraer selectivamente una proteína metálica a partir de suero lácteo, se describe un método que comprende una etapa de poner en contacto suero lácteo con partículas porosas inorgánicas (partículas de sílice) revestidas con dextrano que comprende grupos carboxilos o grupos sulfónicos. La pureza de la lactoperoxidasa producida en este método es de aproximadamente 50% como máximo y hay un problema, en cuanto que, con el fin de producir latoperoxidasa de pureza elevada, es necesario aumentar la... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir lactoperoxidasa, que comprende:

- una etapa (1) para poner en contacto uno o más materiales lácteos con un intercambiador de cationes que tiene grupos débilmente ácidos como grupos de intercambio de iones para efectuar así un tratamiento de adsorción;

- una etapa (2) para lavar el intercambiador de cationes después de dicho tratamiento de adsorción;

- una etapa (3) para poner dicho intercambiador de cationes lavado en contacto con un disolvente de lixiviación que tiene una resistencia iónica de 0, 07 a 0, 3 y eluye lactoperoxidasa para obtener así una solución de lixiviación que tiene lactoperoxidasa eluida en dicho eluyente de lixiviación;

- una etapa (4) para concentrar dicha solución de lixiviación a través de una membrana de ultrafiltración de forma que el contenido de proteínas en dicha solución de lixiviación concentrada resulta ser de 0, 9 a 15%, para efectuar así la precipitación de proteínas como impurezas en la solución de lixiviación concentrada; y

- una etapa (5) para obtener una solución de lactoperoxidasa separando la precipitación de proteínas como impurezas a partir de dicha solución de lixiviación concentrada.

2. Un proceso para producir lactoperoxidasa según la reivindicación 1, en el que la capacidad de adsorción de lactoferrina de dicho intercambiador de cationes es de 85 mg/10 ml o más.

3. Un proceso para producir lactoperoxidasa según la reivindicación 1 ó 2, en el que dichos grupos de intercambio de iones son grupos carboximetilo.

4. Un proceso para producir lactoperoxidasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el disolvente de lixiviación usado en dicha etapa (3) es una solución acuosa que contiene al menos una sal seleccionada entre un grupo que consiste en cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

5. Un proceso para producir lactoperoxidasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente una etapa de obtener lactoperoxidasa sólida separando el disolvente de la solución de lactoperoxidasa obtenida en dicha etapa (5) .

6. Un proceso para producir lactoperoxidasa según la reivindicación 5, en el que la pureza de la lactoperoxidasa sólida es de 80% o más.