Proceso para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico.

Un proceso para la producción de ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico o ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico en plantas transgénicas que producen semillas maduras con un contenido de por lo menos 1 5 % en peso de dichos compuestos denominados como el contenido total de lípidos de dicho organismo que comprende las siguientes etapas:

a) introducción de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-1 2-desaturasa- y Δ-15-desaturasa, y

b) introducción de por lo menos una segunda secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad Δ-9-elongasa, y

c) introducción de por lo menos una tercera secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-8-desaturasa, y

d) introducción de por lo menos una cuarta secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un polipéptido que tiene una actividad Δ-5- desaturasa, y

e) cultivo y cosecha de dicha planta transgénica, en donde las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos tienen actividad Δ-12-desaturasa y Δ-15-desaturasa, actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9-elongasa o Δ-5- desaturasa se seleccionan del grupo que consiste de

i) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, y

ii) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 de acuerdo con la degeneración del código genético,

iii) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad Δ-12-desaturasa y δ-15-desaturasa, actividad Δ-8-desaturasa, Δ-9- elongasa o Δ-5-desaturasa.

Proceso Para la Producción de Ícido Araquidónico y/o Ícido Eicosapentanóico.

La presente invención se relaciona con un nuevo proceso para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico en plantas a través de la coexpresión de una A-12-/A-15-desaturasa, A-9-elongasa, A-8desaturasa y una A-5-desaturasa y un proceso para la producción de lípidos o aceites que tienen un contenido aumentado de ácidos grasos insaturados, en particular ácidos grasos w-3 y w-6 que tienen por lo menos dos enlaces dobles y una longitud de cadena de 18 a 20 átomos de carbono. Preferiblemente el ácido araquidónico y el ácido eicosapentanóico se producen en por lo menos una relación 1:2.

La invención se relaciona adicionalmente con la producción de una planta transgénica, preferiblemente una planta de cultivo transgénico, que tiene un contenido aumentado de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanóico, aceites o lípidos que contienen ácidos grasos C18 o C20 con un enlace doble en la posición º5, 8, 9, 11, 12, 14, 15 o 17 del ácido graso producido, respectivamente debido a la expresión de la º-12-/º-15-desaturasa, de la º-9-elongasa, de la º-8-desaturasa y de la º-5-desaturasa en la planta. La expresión de la º-12-/º-15-desaturasa de la invención conduce preferiblemente a ácido linoleico y ácido a-linolénico como productos que tienen un enlace doble en la posición A 9, 12 y 15 del ácido graso.

La invención se relaciona adicionalmente con secuencias de ácidos nucleicos específicas que codifican las proteínas con actividad º-12-/º-15- desaturasa, construcciones de ácido nucleico, vectores y plantas transgénicas que contienen dichas secuencias de ácido nucleico.

Las plantas y especialmente los cultivos de aceite se han utilizado durante siglos como fuentes para productos comestibles o no comestibles. Existen registros escritos y excavaciones arqueológicas de cultivos de aceite tales como semilla de lino, oliva y sésamo que se utilizaron ampliamente por lo menos hace seis mil años.

Los productos no comestibles de cultivos de semilla de aceite tal como colza se utilizan y se incluyen en lubricantes, lámparas de aceite, y cosméticos tales como jabones. Los cultivos de aceite difieren en sus características culturales, económicas y de utilización, por ejemplo las semillas de colza y de lino se adaptan a climas relativamente fríos, mientras que el aceite de palma y coco se adaptan a climas calientes y húmedos. Algunas plantas son plantas oleaginosas reales lo que significa que el producto principal de tales plantas es el aceite, mientras que en el caso de otras tal como algodón o soja el aceite es más o menos un subproducto. Los aceites de diferentes plantas se caracterizan básicamente por su patrón de ácido graso individual.

Los ácidos grasos y triglicéridos tienen numerosas aplicaciones en la industria de los alimentos, nutrición animal, cosméticos y en el sector de los fármacos. Dependiendo de si estos son ácidos grasos insaturados o saturados libres o triglicéridos con un contenido aumentado de ácidos grasos saturados o insaturados, estos son adecuados para las aplicaciones más variadas; así, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (= LCPUFA) se agregan a una fórmula infantil para aumentar su valor nutricional. Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos tales como Mortierella o de plantas oleaginosas tales como soja, aceite de semilla de colza, girasol y otros, en donde estos se obtienen usualmente en la forma de sus triacilglicéridos. Alternativamente, estos se obtienen en forma ventajosa de animales, tales como peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis.

Si se prefieren aceites con ácidos grasos saturados o con ácidos grasos insaturados eso depende de la finalidad prevista; así, por ejemplo, lípidos con ácidos grasos insaturados, específicamente ácidos grasos poliinsaturados, se prefieren en la nutrición humana debido a que estos tienen un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre y así en la posibilidad de enfermedad cardiaca. Se utilizan en una variedad de alimentos dietéticos o medicamentos. Además los PUFA se utilizan comúnmente en alimentos, comidas y en la industria cosmética. Los ácidos grasos w3-y/o w-6 poliinsaturados son una parte importante de alimentos para humanos y comidas para animales. Debido a la composición común de los ácidos grasos w-3- poliinsaturados de alimentos humanos, que son un componente esencial del aceite de pescado, se debe agregar al alimento para aumentar el valor nutricional del alimento; así, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido Docosahexaenoico (= DHA, C22:6 º4, 7, 10, 13, 16, 19) o ácido eicosapentanóico (= EPA, C20:5 º5, 8, 11, 14, 17) se agregan como se mencionó anteriormente a la fórmula infantil para aumentar su valor nutricional. Mientras que el DHA tiene un efecto positivo en el desarrollo del cerebro de los bebés. La adición de ácidos grasos w-3 poliinsaturados se prefiere como la adición de ácidos grasos w-6 poliinsaturados como ácido araquidónico (= ARA, C20:4 º5, 8, 11, 14) al alimento común tiene un efecto indeseado por ejemplo en enfermedades reumáticas tal como artritis reumatoide. Los ácidos grasos w-3- y w-6 poliinsaturados son precursores de una familia de hormonas paracrinas llamadas eicosanoides tal como prostaglandinas que son productos del metabolismo de ácido Dihomo-y- linoleico, ARA o EPA. Los eicosanoides están implicados en la regulación de la lipólisis, el inicio de respuestas inflamatorias, la regulación de la circulación y la presión sanguínea y otras funciones centrales del cuerpo. Los eicosanoides comprenden prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, y prostaciclinas. Los ácidos grasos w-3 parecen evitar la arterosclerosis y enfermedades cardiovasculares principalmente al regular los niveles de diferentes eicosanoides. Otros eicosanoides son los tromboxanos y leucotrienos, que son productos del metabolismo de ARA o EPA.

Principalmente los microorganismos tales como Mortierella o plantas oleaginosas tal como soja, colza o girasol o algas tal como Cr y pthecodinium o Phaeodactylum son una fuente común de aceites que contienen PUFA, en donde estos se obtienen usualmente en la forma de sus glicéridos triacilo. Alternativamente, estos se obtienen ventajosamente de animales, tal como peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis con una base fuerte tal como hidróxido de potasio o de sodio.

Los aceites de planta son en general ricos en ácidos grasos tales como ácidos grasos monoinsaturados como ácido oleico o ácidos grasos poliinsaturados (= PUFA) como ácido linoleico o linolénico. Los LCPUFA como ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico se encuentran raramente en plantas algunas excepciones son especies Nephelium y Salvia en las que se encuentra el ácido araquidónico y algunas especies Santalum en las que se encuentra ácido eicosapentanóico. El ácido docosahexaenoico LCPUFA no se encuentra en plantas. Los LCPUFA tal como DHA, EPA, ARA, ácido Dihomo-y- linoleico (C20:3 º8, 11, 14) o ácido Docosapentaenoico (= DPA, C22:5

7, 10, 13, 16, 19) no se producen por plantas oleaginosas tales como soja, colza, alazor o girasol. Una fuente natural para los dichos ácidos grasos son el pescado por ejemplo arenque, salmón, sardina, pez rojo, anguila, carpa, trucha, mero, caballa, lucio-perca, atún o algas.

Aproximadamente 80% de los aceites y grasas se utilizan en la industria de los alimentos. Cerca de aproximadamente 84 % de los aceites vegetales usados en todos el mundo se derivan de solo seis cultivos/ cultivos de aceite, que son soja, aceite de palma, colza, girasol, algodón, y nuez molida.

A causa de sus propiedades positivas no ha habido falto de intentos en el pasado para hacer genes disponibles que participan en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos que tienen un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, en la patente WO 91/13972 y su equivalente Estadounidense se describe una º-9-desaturasa. En la patente WO 93/11245 se reivindica una º-15-desaturasa y en la WO 94/11516 una º-12-desaturasa. La patente WO 00/34439 describe una º-5- y º-8-desaturasa. Se describen otras desaturasas, por ejemplo, en la patente EP-A-0 550 162, WO94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lipids... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para la producción de ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico o ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico en plantas transgénicas que producen semillas maduras con un contenido de por lo menos 1 % en peso de dichos compuestos denominados como el contenido total de lípidos de dicho organismo que comprende las siguientes etapas:

a) introducción de por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-1 2-desaturasa- y º-15-desaturasa, y b) introducción de por lo menos una segunda secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad º-9-elongasa, y c) introducción de por lo menos una tercera secuencia de ácidos nucleicos en dicha planta transgénica, que codifica un polipéptido que tiene una actividad A-8-desaturasa, y d) introducción de por lo menos una cuarta secuencia de ácidos nucleicos, que codifica un polipéptido que tiene una actividad º-5- desaturasa, y e) cultivo y cosecha de dicha planta transgénica, en donde las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos tienen actividad º-12-desaturasa y º-15-desaturasa, actividad º-8-desaturasa, º-9-elongasa o º-5desaturasa se seleccionan del grupo que consiste de i) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, y ii) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 de acuerdo con la degeneración del código genético, iii) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 que codifican los polipéptidos tienen por lo menos 70 % de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad º-12-desaturasa y º-15-desaturasa, actividad º-8-desaturasa, º-9- elongasa o º-5-desaturasa.

2. El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la planta transgénica que produce semillas maduras es una planta oleaginosa.

3. El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la planta transgénica que produce semillas maduras se selecciona del grupo que consiste de las familias de la planta de Anacardiáceas, Asteráceas, Apiáceas, Boragináceas, Brasicáceas, Cannabáceas, Elaeagnáceas, Euphorbiáceas, Fabáceas, Geraniáceas, Gramináceas, Juglandáceas, Leguminosáceas, Lináceas, Litrarieáceas, Malváceas, Onagráceas, Palmáceas, Poáceas, Rubiáceas, Escrofulariáceas, Solanáceas, Esterculiáceas y Teáceas.

4. El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la planta transgénica que produce semillas maduras se selecciona del grupo que consiste del género de planta de Pistacia, Mangifera, Anacardium, Caléndula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Caléndula, Valeriana, Borago, Daucus, Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, Or y chophragmus, Cannabis, Elaeagnus, Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Pelargonium, Cocos, Oleum, Juglans, Wallia, Arachis, Linum, Granada, Gossypium, Camissonia, Oenothera, Elaeis, Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Or y za, Zea, Triticum, Coffea, Mitrún, Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, Theobroma y Camellia.

5. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste de colza, amapola, mostaza, cáñamo, grano de ricino, sésamo, oliva, caléndula, granada, avellana, maíz, almendra, macadamia, algodón, aguacate, calabaza, nuez, laurel, pistacho, primavera, canola, onagra, aceite de palma, cacahuete, semilla de lino, soja, alazor, caléndula, café, tabaco, cacao, girasol y borraja.

6. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido araquidónico o ácido eicosapentanóico o ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se aísla en la forma de sus aceites, lípidos de ácidos grasos libres.

7. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se produce en por lo menos una relación 1:2.

8. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ácido araquidónico y ácido eicosapentanóico se producen en un contenido de por lo menos 5 % en peso denominados como el contenido total de lípidos.

9. El proceso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la º-12-desaturasa- y

º-15-desaturasa utilizadas en el proceso desatura los ácidos grasos C16 o C18 que tienen un enlace doble en la cadena de ácido graso o los ácidos grasos C16 y C18 que tienen un enlace doble en la cadena de ácido graso.

10. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido que tiene una actividad -12desaturasa y -15-desaturasa seleccionada del grupo que consiste de

i) una secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21;

ii) una secuencia de ácidos nucleicos, que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede derivar de un secuencia de polipéptido como se describe en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22;

iii) derivados de la secuencia de ácidos nucleicos descrita en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22 que codifican los polipéptidos que tienen por lo menos 70% de homología con la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 22 y cuyos polipéptidos tienen actividad º-12-desaturasa y º-15-desaturasa.

11. Un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos aislada como se reivindica en la reivindicación 10.

12. Una construcción de gen que comprende un ácido nucleico aislado que tiene la secuencia SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 como se reivindica en la reivindicación 10, en donde el ácido nucleico se liga funcionalmente a una o más señales reguladoras.

13. Una construcción de gen como se reivindica en la reivindicación 12, cuya expresión de gen se aumenta por las señales reguladoras.

14. Un vector que comprende un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 10 o una construcción de gen como se reivindica en la reivindicación 13.

15. Una planta transgénica que comprende por lo menos un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 10, una construcción de gen como se reivindica en la reivindicación 13 o un vector como se reivindica en la reivindicación 14.

16. La planta transgénica como se reivindica en la reivindicación 15, en donde la planta es una planta oleaginosa.

Figura 2A: Comparación del perfil de ácido graso de levadura transformada con las construcciones pYES2 (2A) como control y construcción pYES2-12Ac (2B) . Se marcan los ácidos grasos. Los nuevos ácidos grasossintetizados son en el caso de construcción de pYES2-12Ac (2B) de los ácidos grasos C16:2, C16:3, C18:2 yC18:3.