Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales.

Procedimiento para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales,

caracterizado porque losmicroorganismos se cultivan en un medio de fermentación que presenta CaCO3 como medio esencial para laestabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de fermentación, siendoentonces CaCO3 un medio esencial para la estabilización del valor de pH si la suma de diferencias de valores de pH,que se pueden medir con o sin adición de ácidos, - en cada caso con la adición de CaCO3 según la invención - esmenor o igual a 1.

Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales

Diversos ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs para polyunsaturated fatty acids) , y especialmente ácidos grasos omega-3 (ácidos grasos n3) , son componentes esenciales de la nutrición humana.

Sin embargo es sabido que en la mayor parte de naciones industriales, el abastecimiento con ácidos grasos n3 es deficiente. Por el contrario, la fracción grasa total en la nutrición, así como la alimentación de ácidos grasos saturados y ácidos grasos n6 es demasiado elevada. Esto se basa en una modificación de nuestra composición alimenticia, que ha tenido lugar sobre todo aproximadamente en los últimos 150 años, y se ha correlacionado con la aparición de diversas enfermedades crónicas de la civilización, como por ejemplo enfermedades circulatorias - la causa principal de mortandad en zonas industriales - (Simopoulos, A. P., 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70, 560-569) . Entre tanto, una pluralidad de estudios ha mostrado que mediante el aumento selectivo de la alimentación de ácidos grasos n3, en especial de ácido eicosapentanoico (EPA) y de ácido docosahexanoico (DHA) , se puede reducir significativamente el riesgo circulatorio (GISSI-Prevenzione Investigators (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell, Infarto miocardico) , 1999, Dietar y suplementation with n-3polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-pevenzione trial., Lancet 3544, 447-455; Burr et al., 1989, Effects of changes in fat, fish, and fibre intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART) . Lancet 2, 757-761) : correspondientemente se recomienda por diversas organizaciones (WHO, FAO, AHA, ISSFAL, British Nutrition Foundation u.v.a.) aumentar significativamente la alimentación de ácidos grasos n3 (Kris-Eherton et al., Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease. Circulation 2002, 2747-2757) .

Fuentes para la obtención de PUFAs, y en especial ácidos grasos n3, son sobre todo peces marinos de agua fría y aceites obtenidos a partir de los mismos, pero también microorganismos marinos que tienen la ventaja, frente a peces, de poder ser empleados en fermentadores para la producción de PUFAs bajo condiciones económicas y controladas. En el caso de una obtención por fermentación no existe peligro de impurezas, como se describen para peces o aceites de pescado obtenidos a partir de los mismos (Olsen SF. Int J Epidemiol. 2001: 1279-80) . Además se puede influir positivamente sobre la composición de los aceites obtenidos mediante selección del organismo y las condiciones de cultivo, y no se está sometido a fluctuaciones de temporada, como se describe igualmente para peces y productos de pescado (Gamez-Meza et al. Lipids 1999: 639-42) .

Microoganismos que son apropiados para la obtención de PUFA n3 se encuentran, a modo de ejemplo, en las bacterias bajo la especie Vibrio (por ejemplo: Vibrio marinus) , o bajo los Dinoflagellaten (Dinophyta) , en especial la especie Cr y pthecodinium, como C. cohnii, o bajo los Stramenopiles, como Pinguiophyceae, como por ejemplo Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochr y sis, Pinguiococcus y Polydochr y sis. Microorganismos preferentes para la obtención por fermentación de PUFA pertenecen a Stramenopiles (o Labyrinthulomycota) , en especial a la especie Thraustochytriales (Thraustchytriidea) , y a su vez en particular a las especies Japonychytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium y Ulkenia.

Es sabido que algunos de los citados microorganismos se pueden emplear para la producción industrial de ácidos grasos, se describieron algunos procedimientos. De este modo, la solicitud de patente internacional WO 91/07498 A1 da a conocer la obtención de PUFAs con organismos de las especies Schizochytrium y Thraustochytrium. La WO 91/11918 A1 da a conocer la obtención de PUFAs con Cr y pthecodinium cohnii, la WO 96/33263 A1 y la correspondiente solicitud de patente europea EP 0 823 475 A1 describen la obtención de PUFAs con microorganismos de la especie Schizochytrium, mientras que la solicitud de patente WO 98/03671 da a conocer la obtención de PUFAs con microorganismos de la especie Ulkenia.

El espacio vital natural de los microorganismos descritos, y en especial de Labyrinthulomycota, son hábitats marinos. Convencionalmente, éstos microorganismos se cultivan en medios correspondientemente salinos, definiéndose el contenido en sal del agua marina en 32-35 g/l, y una fracción de un 90-95 % en sodio y cloruro, para los fines de la presente invención. Medios típicos para el cultivo de microorganismos marinos, como Thraustochytrium o Schizochytrium se basan en agua marina (por ejemplo ATCC (American Type Culture Collection) 790 By + Medio [extracto de levadura 1, 0 g, peptona 1, 0 g, D+-glucosa 5, 0 g, agua marina 1L]) . No obstante, también se sabe que los microorganismos de la especie Thraustochytriales pueden sobrevivir en el medio de cultivo con salinidad muy reducida. No obstante, su crecimiento se considera muy reducido y sin máximos intermedios en el intervalo de salinidad reducido por debajo de un límite de 7, 5 - 15 g de sal/L, correspondientemente a una salinidad de un 7, 5 15 %. Se consiguen velocidades de crecimiento óptimas sólo por encima de los límites de salinidad indicados anteriormente (Fan et al. Botanica Marina 45, 2002, páginas 50-57) .

Un problema de procesos fermentativos que se presenta frecuentemente son las fuertes oscilaciones de pH en el desarrollo del cultivo como consecuencia de la aparición de productos metabólicos y/o del consumo de componentes de medio aislados. Esto es válido en especial para medios ricos en sales para la fermentación de microorganismos marinos. Por lo tanto, tales fermentaciones requieren frecuentemente una regulación de pH. Sin embargo, en el caso de fermentaciones a gran escala, el control del valor de pH conduce a un gasto añadido considerable. En este caso

se requieren depósitos adicionales para la adición de ácidos y bases, que se pueden emplear de otro modo para la alimentación de componentes aditivos. Además, la titración para la regulación del valor de pH se debe controlar técnicamente. En relación con la fermentación de Labyrinthulomycota para la obtención de PUFA a escala de producción, en el estado de la técnica se emplean métodos de cultivo controlados mediante el valor de pH.

No obstante, el control del valor de pH a través de sistemas tampón, habituales en el cultivo celular por lo demás, presenta inconvenientes. De este modo, la capacidad de tamponaje, por ejemplo, de TRIS, HEPES y MOPS debido a sus valores de pKa por encima de 7 no es suficiente en el intervalo de pH necesario para la fermentación de PUFA. TRIS es además un mal tampón en los intervalos de pH por debajo de 7, 5, una amina primaria potencialmente reactiva, y puede participar activamente en las más diversas reacciones biológicas. El tampón fosfato, un tampón igualmente empleado con frecuencia, tiene la propiedad de precipitar a partir de la disolución en presencia de cationes divalentes, y además es una mala elección en procesos fermentativos, que requieren, o bien consumen fosfato. Debido a su estrecho intervalo de tamponaje, y debido al hecho de ser metabolizado en el transcurso de la fermentación, el tampón acetato es inapropiado. Además, debido a los costes elevados, muchos sistemas tampón alternativos son poco rentables.

Por lo tanto, considerando el estado de la técnica, era tarea de la presente invención poner a disposición un procedimiento de cultivo nuevo, sencillo y económico para microorganismos marinos. En este caso se conseguirá una simplificación considerable del control de proceso. Aparte de la eficiencia de costes, el procedimiento posibilitará la obtención de PUFAs altamente puros en rendimiento elevado.

Estos problemas, así como otros no citados explícitamente, pero que se pueden derivar o deducir de los contextos aquí discutidos preliminarmente, se solucionan mediante el objeto que está definido en las reivindicaciones de la presente invención. La presente invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales, en el que los microorganismos se cultivan en un medio de fermentación que presenta CaCO3 como medio esencial para la estabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de fermentación, siendo CaCO3 un medio esencial para la estabilización del valor de pH si la suma de diferencias de valores de pH, que se... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales, caracterizado porque los microorganismos se cultivan en un medio de fermentación que presenta CaCO3 como medio esencial para la estabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de fermentación, siendo entonces CaCO3 un medio esencial para la estabilización del valor de pH si la suma de diferencias de valores de pH, que se pueden medir con o sin adición de ácidos, - en cada caso con la adición de CaCO3 según la invención - es menor o igual a 1.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, dando los microorganismos una producción de más de un 25, preferentemente de más de un 35, y de modo muy especialmente preferente de más de un 45 % en peso de aceite por unidad ponderal de biomasa seca.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, dando los microorganismos una producción de más de un 10, preferentemente de más de un 14, de modo especialmente preferente de más de un 18, y de modo muy especialmente preferente de más de un 22 % en peso de ácido docosahexenoico (DHA) por unidad ponderal de biomasa seca.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, dando los microorganismos una producción de más de un 1 %, preferentemente más de un 2 %, de modo especialmente preferente más de un 3 %, y de modo muy especialmente preferente de más de un 4 % de ácido docosapentanoico (DHA) por biomasa seca.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, añadiéndose al medio 3 g/L a 15 g/L, preferentemente 4 g/L a 12 g/L, de modo especialmente preferente 5 g/L a 10 g/L, y de modo muy especialmente preferente 7, 5 ± 0, 5 g/L de CaCO3.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio comprende glucosa, agua viva de maíz, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, carbonato de calcio, sulfato sódico, sulfato amónico e hidrogenofosfato potásico.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio presenta un valor de pH entre 3 y 10, preferentemente entre 5 y 7.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se efectúa entre 10ºC y 40ºC, preferentemente entre 25ºC y 35ºC.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se efectúa durante 1 a 10 días, preferentemente durante 3 a 9 días.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el microorganismo pertenece a la especia Schizochytrium, Thraustochytrium o Ulkenia.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el microorganismo es Ulkenia spec. SAM 2179.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el microorganismo es Schizochytrium spec. SR 21.

13. Empleo de un medio de cultivo que comprende como agente esencial para la estabilización del valor de pH CaCO3, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de cultivo, para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochyriales.