Procedimiento de obtención de antioxidantes naturales, caracterizado porque (a) se cultivan cepas de las algas verdes Chlorella sorokiniana SAG 211-32 en un medio de cultivo que comprende sales de ácido acético de 20 a 60 mM y con una irradiación con luz de desde 500 hasta 1.

000 6mu;E m -2 s -1 para producir luteína hasta que se alcanza un contenido deseado del antioxidante, (b) se cosechan las algas y se usan como producto y/o (c) se retira el contenido de luteína por separación de la biomasa restante

Procedimiento de obtención de luteína a partir de algas Objeto de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de luteína a partir de una cepa de Chlorella sorokiniana específica.

Estado de la técnica

La luteína, junto con la zeaxantina, es un componente esencial del pigmento macular en la retina del ojo. Un nivel bajo de consumo de este carotenoide particular aumenta el riesgo de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y cataratas, que son las causas principales de deterioro visual y ceguera adquirida, y son cuestiones claves de calidad de vida entre millones de personas que están envejeciendo. Uno de los primeros estudios a gran escala sobre carotenoides es el Eye Disease Case Control Study (estudio de control de casos de enfermedades oculares) , en el que se comparó la dieta con el riesgo de desarrollar AMD. Los resultados encontraron un riesgo significativamente inferior de desarrollar la enfermedad ocular en personas que mostraban grandes cantidades de luteína y zeaxantina en su sangre. Además, las personas que siguieron una dieta con las cantidades más altas de luteína y zeaxantina desarrollaron un riesgo significativamente inferior de AMD que aquéllas cuya dieta contenía la cantidad más baja (de tan sólo 1, 2 mg al día) . Estudios dietéticos confirmaron la asociación entre el consumo frecuente de espinacas o col, que son buenas fuentes particulares de luteína y zeaxantina, y el riesgo de AMD inferior. Se encontraron resultados similares en un análisis reciente de un estudio dietético de EE.UU. denominado el Third National Health and Nutrition Examination Survey (tercera encuesta nacional de examen de salud y nutrición) o NHANES III. Este análisis también mostró que consumir luteína y zeaxantina estaba asociado con un riesgo reducido de desarrollar AMD.

La luteína (3, 3'-dihidroxi-β, ε-caroteno) representa una xantofila o carotenoide oxigenado. El sistema de dobles enlaces conjugados determina su color amarillo y es responsable de la acción biológica.

Luteína Las propiedades fisiológicas de la luteína y particularmente su función como un antioxidante se deben a su potencial para inactivar el oxígeno singlete y extinguir radicales activos. Hasta el día de hoy, la luteína se produce principalmente de manera sintética puesto que el contenido de este carotenoide en fuentes naturales se considera que es bastante bajo para cualquier producción industrial en condiciones económicas. En el caso de cultivos heterótrofos de lote alimentado de Chlorella protothecoides, se obtuvo una productividad de luteína promedio de 22, 7 m l-1 d-1 en un fermentador de 3, 7 l. (Biotechnol. Prog., 18, 723-727 (2002) ) . Chlorella zofingiensis que se hizo crecer de manera autótrofa en cultivo discontinuo mostró contenidos de luteína de 20 mg/l (= 4 mg/peso seco) , sin embargo crece lentamente (tiempo de duplicación de 17, 3 h) y por tanto su productividad es mala [Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 848-654 (2004) ]. Muriellopsis se hizo crecer de manera autótrofa en cultivo discontinuo mostrando un contenido máximo de luteína en los cultivos de 35 mg l-1 y una productividad estimada de 32, 6 mg l-1 h-1 en condiciones de crecimiento nutricionales y ambientales optimizadas [J. Biotechnol. 76, 51-59 (2000]. Además, varias patentes reivindican el uso de diversas cepas de Chlorella para la producción de luteína, sin embargo, su productividad es demasiado baja para una producción industrial en condiciones económicas aceptables [documentos US 4.931291; EP 0251018 A1]. La cepa H-84 de Chlorella sorokiniana produce 4, 3 mg luteína/g peso seco [J. Applied Phycology, 12, 263-267 (2000) ]. Actualmente, la luteína se produce a partir de plantas, principalmente flores de caléndula, que requieren grandes extensiones de tierra mostrando un contenido bastante bajo de luteína.

El complejo problema que subyace a la presente invención ha sido por tanto desarrollar un procedimiento que permite la obtención de la luteína a partir de fuentes naturales en rendimientos superiores con comparación con el estado de la técnica, más particularmente a partir de algas que muestran simultáneamente

• una tasa de crecimiento específico μ en condiciones de luz medias de al menos 0, 05 h-1 (medidas en condiciones fototrópicas usando medios inorgánicos) ;

• una producción de biomasa por volumen en irradiación con luz media y en condiciones fototrópicas usando medios inorgánicos de al menos 8 g de biomasa seca/1;

• una razón de luteína/zeaxantina de más de 5;

• un factor obtenido mediante multiplicación de la tasa de crecimiento y productividad volumétrica de luteína de al menos 0, 02 mg l-1h-2

• una razón de clorofila a/luteína de menos de 10, y

• una productividad de luteína volumétrica de al menos 0, 2 mg l-1h-1.

Además, el material de partida debe ser fácil de cultivar y de cosechar de modo que es posible llevar a cabo la reacción en un foto-biorreactor. Finalmente, las fuentes deben estar libres de cualquier toxina nociva o debe cultivarse en tales condiciones que no produzcan toxinas para evitar formación de toxinas nocivas, y deben ser resistentes a la contaminación.

Descripción de la invención La presente invención reivindica un procedimiento de obtención de antioxidantes naturales, que está caracterizado porque

(a) se cultivan cepas de las algas verdes Chlorella sorokiniana SAG 211-32 en un medio de cultivo que comprende sales de ácido acético 20-60 mM y con una irradiación con luz de desde 500 hasta 1.000 μE m-2s-1 para producir luteína hasta que se alcanza un contenido deseado del antioxidante,

(b) se cosechan las algas y se formulan para dar un producto y/o

(c) se retira el contenido de luteína por separación de la biomasa restante.

Sorprendentemente, se ha encontrado que las algas verdes del tipo citado muestran una potente producción de luteína que satisface satisfaciendo los complejos requisitos tal como se indicó anteriormente, lo que permite obtener el producto de alto valor en una cantidad significativamente superior en comparación con cualquier otra alga conocida indicada en el estado de la técnica. Particularmente, Chlorella sorokiniana también muestra varias ventajas adicionales; en comparación con otras algas muestra crecimiento rápido (tiempo de duplicación de 3 h) , no se aglutina y es fácil de manejar, de modo que es adecuada para el cultivo, especialmente en foto-biorreactores tubulares. Crece de manera autótrofa o mixotrófica en un medio mineral económico y muy simple y es resistente con respecto a la contaminación.

Algas verdes Chlorella sorokiniana SAG 211-32 no sólo muestra una alta productividad con respecto a la luteína, sino que también muestra la mejor resistencia contra agentes contaminantes, la tasa de crecimiento más rápida y no se aglutina.

Condiciones de cultivo

Se conocen muchas condiciones de cultivo y medios de cultivo para cultivos madre a escala pequeña y cultivos a gran escala de células algales. Sin embargo, para los fines de la presente invención, se encontró que las condiciones y medios de cultivo óptimos son en realidad las condiciones y medios de cultivo relativamente simples descritos a continuación en el presente documento, siendo estos por tanto los preferidos según la invención. Por ejemplo, la temperatura siempre es un factor crítico para el crecimiento de las algas. Se ha encontrado que se logran condiciones muy favorables entre 20 y 40ºC con un óptimo a aproximadamente 30ºC.

En una realización adicional preferida de la invención, se hacen crecer las algas de manera mixotrófica (con nutrientes adicionales para potenciar el crecimiento de las células) , más particularmente, se ha encontrado que el medio Arnon soporta el crecimiento de una manera óptima, preferiblemente si se combina con nitratos en cantidades de 10 a 60 mM, preferiblemente de aproximadamente 40 mM. La tasa de crecimiento también puede aumentarse mediante la adición de sales de ácido acético, en particular acetato de sodio, en cantidades de 20 a 60 mM, preferiblemente de aproximadamente 40 mM.

Finalmente, la irradiación es también un parámetro crítico. Con respecto a pruebas de selección y en planta piloto, su usan lámparas de haluro de mercurio y el cultivo se lleva a cabo con una irradiación con luz de 200 a 1.500, y preferiblemente de aproximadamente 700 μEm-2s-1. Para la producción, por supuesto, se prefieren las condiciones de luz natural.

En una realización adicional preferida de la presente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de antioxidantes naturales, caracterizado porque (a) se cultivan cepas de las algas verdes Chlorella sorokiniana SA.

21. 32 en un medio de cultivo que comprende sales de ácido acético de 20 a 60 mM y con una irradiación con luz de desde 500 hasta 1.000 μE m-2s-1 para 5 producir luteína hasta que se alcanza un contenido deseado del antioxidante,

(b) se cosechan las algas y se usan como producto y/o

(c) se retira el contenido de luteína por separación de la biomasa restante.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo de las algas se realiza a una temperatura de desde 20 hasta 40ºC.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y/o 2, caracterizado porque el cultivo se realiza usando un medio de cultivo mixotrófico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 anteriores, caracterizado porque el cultivo se realiza con estrés.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 anteriores, caracterizado porque el cultivo se realiza 15 en un foto-biorreactor.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 anteriores, caracterizado porque se recogen las células cultivadas en la etapa (b) para formar una suspensión concentrada, opcionalmente se añaden antioxidantes y emulsionantes a dicha suspensión, y opcionalmente se rompen las células recogidas y se secan para obtener luteína o un producto enriquecido con luteína.