Procedimiento y medio para la detección de virus de papiloma humanos.

Sistema PCR comprendiendo un juego de cebadores consistente en un cebador hacia adelante con la secuencia denucleótidos SEC ID nº.

57 y un cebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 58, un juego decebadores de un cebador hacia adelante con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 59 y un cebador hacia atrás con lasecuencia de nucleótidos SEC ID nº. 60, consistiendo un juego de cebadores en un cebador hacia adelante con lasecuencia de nucleótidos SEC ID nº. 61 y un cebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 62 y unjuego de cebadores consistiendo en un cebador hacia adelante con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 63 y uncebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº. 64.

Procedimiento y medio para la detección de virus de papiloma humanos [0001] La presente invención se refiere a un sistema PCR para la detección de infecciones con virus del papiloma humanos (HPV) y un procedimiento correspondiente. Además la presente invención se refiere a un kit para la detección de infecciones con HPV.

Virus del papiloma humanos (HPV) muestran en su estructura de genoma una estructura unitaria. Ya son conocidos más de 150 virus de papiloma humanos diferentes. Una denominación del HPV se realiza numéricamente continua, subdividida según su secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) . Los virus del papiloma humanos se pueden estructurar en tres grupos: HPV mucocutáneos (formación de verrugas) , asociados a epidermodisplasia (neoplasias cutáneas) y anogenitales (condilomas, carcinomas anales y de cérvix) .

Los virus del papiloma están difundidos por todo el mundo. Infecciones con estos virus son de tipo y en gran parte órgano-específicos. HPV presentan un genoma anular; que codifica todos los genes virales. Una subdivisión de los genes se realiza por sus fases de expresión en genes tempranos, los llamados "early genes", E1 a E8, y genes tardíos, los llamados "late genes" , L1 y L2. Proteínas de los genes tempranos poseen entre otros funciones reguladoras e influyen el crecimiento celular de células humanas infectadas. E6- y E7-productos de gen tienen características transformadoras y son responsables de la potencia oncogénica de tipos de virus, particularmente los tipos de virus HPV 16 y HPV 18.

En la infección con el virus papiloma humano se trata de una infección de contacto. Hay una multitud de apariciones clínicas, que dependen mucho del tipo de virus, del tejido afectado y de la situación de resistencia del organismo infestado. Infecciones activas, clínicamente relevantes presentan una probabilidad aumentada de una integración de ADN viral en el genoma humano. Así aumenta la probabilidad de una degeneración tumoral de células. Otros cofactores como inmunosupresión, infección de VIH, fumar, infecciones de herpes y de clamidia y factores genéticos parecen jugar un papel en la opresión o eliminación de la infección HPV.

Se asocian más de 20 tipos de HPV con carcinomas de cérvix invasivos. El tipos de HPV 6, 11, 30, 42, 43 y 44 y otros se clasifican debido a su escaso riesgo oncogénico como tipos de HPV llamados de bajo riesgo ("low risk") . Por el contrario tipos de HPV de alto riesgo, particularmente los tipos de HPV 16, 18, 45 y 56, presentan un riesgo oncogénico alto ("high risk") . Los virus se pueden probar tanto en displasias ligeras, como también en displasias moderadas a pesadas (neoplasias cervicales intraepiteliales, clasificadas en las clases CIN 1 hasta 3) así como en carcinomas invasivos, particularmente en carcinomas de cérvix. Se considera como [0006] asegurado, que los HPV representan factores de riesgo necesarios para el origen de enfermedades de cáncer, particularmente de cáncer de cérvix. Particularmente los tipos de VPH 16 y 18 se asocian a carcinomas de cérvix invasivos.

Terapias antivirales específicas, particularmente por vacunaciones, pueden estar disponibles en un futuro próximo, sin embargo pasará un período de tiempo más largo, hasta que terapias de este tipo hayan sido impuestas. Áreas de mucosa o de piel infectadas son tratadas también además según el tamaño por láser, crioterapia o escisión. Con formas malignas de enfermedades en la zona genital generalmente es necesario una eliminación operativa (resección) . Un programa de diagnóstico precoz efectivo por lo tanto sigue siendo irrenunciable.

Estadios tempranos de carcinomas de cérvix son actualmente principalmente captados por toma de una citología celular (citología cervical, también denominada como citología de Papanicolaou, abreviado citología de Pap) , en cooperación con una colposcopia. Aunque la introducción de programas de prevención citológicos ha conducido a un decremento de la incidencia de carcinomas de cérvix, no se ha podido lograr hasta ahora ninguna otra disminución significativa. Procedimientos citológicos están afectados con un error subjetivo relativamente grande, no estandarizados y no pueden proveer ningunos resultados satisfactorios sobre el desarrollo posterior de lesiones individuales. Cultivo y proliferación cultural de HPV son técnicamente muy costosos y se excluyen por lo tanto como prueba. Procedimientos inmunohistoquímicos no son lo suficientemente sensibles, exámenes serológicos con demostración de anticuerpos específicos de HPV no tienen ningún significado para el diagnóstico, ya que con pacientes con carcinoma de cérvix sólo son demostrables anticuerpos en la mitad de todos los casos.

Para particularmente con una comprobación citológica llamativa poder adoptar una declaración sobre un desarrollo posible de tumores malignos, se utilizan procedimientos de detección para ácidos nucleicos virales en muestras de tejido clínicas. Particularmente procedimientos para la distinción de tipos individuales de infecciones de HPV de bajo y alto riesgo. Un procedimiento de hibridación de refuerzo de señal de la compañía Digene se conoce como microplaca de captura de híbrido (método HCM) . El método HCM usa secuencias de ARN específicas de HPV como sondas de hibridación. La detección de híbridos ARN/ADN se realiza en microplacas mediante anticuerpos conjugados enzimáticamente en un procedimiento fotométrico. Algunos tipos de alto riesgo sin embargo no pueden ser registrados y pueden aparecer reacciones cruzadas entre ambas clases de HPV. Con ello hay que considerar especialmente lo importantes que son resultados falso negativos o falso positivos para la psiquis de pacientes. Resultados de este tipo se deben evitar por lo tanto en lo posible.

Muchos procedimientos conocidos en el estado de la técnica para la comprobación de ácidos nucleicos virales en muestras de tejido clínicas se basan sobre una amplificación de HPV- ADN. En el procedimiento de reacción de cadena de polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) se realiza con ayuda de iniciadores específicos la amplificación del ADN de manera tipo específico.

La solicitud de patente europea EP 05009276 de la solicitante y la solicitud PCT WO 2005/056839 divulgan kits y procedimientos con medios para la comprobación de diferentes tipos de HPV. Son describen a este respecto iniciadores y sondas de oligonucleótidos, como método para la amplificación se realiza preferiblemente el PCR.

Una desventaja notable de procedimientos comerciales conocidos para la comprobación y para la tipificación de genotipos HPV consiste sobre todo en que son utilizadas áreas ADN del HPV poco conservadas como modelo para iniciadores y sondas de oligonucleótido. Esto vale particularmente para sondas e iniciadores de áreas L1. Procedimientos de detección basados en ello presentan de manera condicionada por una variedad de bases alta en estas áreas sólo una especificidad pequeña de sus sondas e iniciadores. De esta manera pueden ser condicionados resultados de prueba de falsos negativos.

Por consiguiente existe una necesidad médica constante de procedimientos rápidos y sencillos para la comprobación segura de tipos de HPV diferentes.

Es por lo tanto tarea de la presente invención, proveer un procedimiento de detección poco complicado para ácidos nucleicos virales, particularmente de áreas ADN del HPV, así como medios para ello, y también un kit para la ejecución del procedimiento, de modo que esté garantizada una seguridad óptima para resultados de detección.

La presente invención resuelve el problema técnico de base a través de la puesta a disposición de un sistema PCR, procedimiento y lote como se define en las reivindicaciones 1-10.

En el marco de esta invención los conceptos sondas de oligonucleótido, oligonucleótido y sondas de gen deben ser entendidos equivalentemente.

Para la detección in-vitro de una infección viral con tipos de HPV individuales, particularmente también varios, es oportuno efectuar una amplificación de ADN del HPV. En una forma de ejecución preferida de la invención para la amplificación de ADN se realiza una reacción en cadena de polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) . En el PCR se trata de un método para multiplicar de manera dirigida ácidos nucleicos o secciones determinadas de ácidos nucleicos en vitro, sin emplear un organismo vivo. El PCR se estructura en ciclos de pasos sucesivos de desnaturalización, de hibridación y de alargamiento. En el paso de desnaturalización se... [Seguir leyendo]

1. Sistema PCR comprendiendo un juego de cebadores consistente en un cebador hacia adelante con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 57 y un cebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 58, un juego de cebadores de un cebador hacia adelante con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 59 y un cebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 60, consistiendo un juego de cebadores en un cebador hacia adelante con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 61 y un cebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 62 y un juego de cebadores consistiendo en un cebador hacia adelante con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº. 63 y un cebador hacia atrás con la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº. 64.

2. Sistema PCR según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los cebadores están marcados, particularmente con biotina.

3. Sistema de PCR según la reivindicación 1 o 2 para la aplicación en la detección de virus del papiloma humanos (HPV) , especialmente para la discriminación entre tipos de alto riesgo y tipos de bajo riesgo de virus del papiloma humanos (HPV) .

4. Sistema de PCR según la reivindicación 1 o 2 para la aplicación en la detección precoz de enfermedades de carcinomas, particularmente de precancerosas, de estas últimas preferiblemente de cáncer de cérvix.

5. Procedimiento para el diagnóstico de infecciones con virus del papiloma humanos (HPV) , comprendiendo los siguientes pasos de proceso,

- detección de ADN con a) control de la calidad de muestras b) prueba sobre HPV de bajo riesgo c) prueba sobre HPV de alto riesgo

caracterizado por el hecho de que la detección de ADN se efectúa sobre áreas específicas del ADN del HPV bajo aplicación de sondas de oligonucleótido con al menos una de las secuencias de nucleótido SEC ID nº. 25 hasta 48 y un sistema PCR según una de las reivindicaciones 1 hasta 4.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que los cebadores se utilizan en grupos, preferiblemente en grupos para áreas comunes y/o para áreas adyacentes del ADN, particularmente del ADN del HPV.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6, caracterizado por el hecho de que los métodos PCR o análogos a métodos PCR se usan como procedimientos de amplificación.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 hasta 7, caracterizado por el hecho de que las sondas de oligonucleótidos se utilizan en una hibridación inversa.

9. Kit para el diagnóstico de infecciones con HPV, especialmente para la realización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 5 hasta 8, que comprende al menos un envase, que presenta al menos una sonda de oligonucleótidos con al menos una de las secuencias de nucleótidos de SEC ID nº. 25 hasta 48, y un sistema PCR según una de las reivindicaciones 1 hasta 4 como medio de detección de HPV de bajo riesgo y/o medio de detección de HPV de alto riesgo.

10. Kit según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que la al menos una sonda de oligonucleótidos se inmoviliza sobre un soporte, particularmente sobre una tira de prueba.