PREPARACIÓN DE TEJIDO PARA IMPLANTACIÓN MENISCAL.

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una matriz de tejido, preferiblemente una matriz de tejido blando, para la sustitución y/o reparación de menisco dañado o defectuoso. La invención también proporciona un tejido de menisco que está sustancialmente descelularizado para posterior trasplante/implantación. ANTECEDENTES La rodilla humana es una articulación importante y compleja que comprende tres huesos espacialmente interrelacionados (fémur, tibia y rótula), ligamentos y estructuras cartilaginosas, que interactúan todas ellas para crear diversos movimientos. Las superficies de los huesos de la rodilla dentro de la articulación están cubiertas con cartílago articular. Esta importante superficie permite que los huesos se deslicen suavemente unos contra otros sin que se produzca daño al hueso. El menisco, una almohadilla de cartílago con forma de C se asienta entre las superficies articulares de cartílago del hueso y actúa como absorbente de impactos distribuyendo el peso y mejora con ello la estabilidad general de la rodilla. Cada articulación de rodilla tiene menisco medial y lateral que se compone de fibrocondrocitos, proteoglicanos y una matriz extracelular de fibras de colágeno y elastina. Cuando los meniscos se dañan por lesión, enfermedad o inflamación artrítica se pueden desarrollar cambios en la articulación de la rodilla con el consiguiente hinchamiento, dolor y/o pérdida de la función de articulación de la rodilla en el individuo afectado. Aun cuando es posible reparar un menisco desgarrado, puede que haya de ser retirado un menisco que esté gravemente dañado o tenga un desgarro extenso. Dado que el cartílago articular en adultos no se regenera naturalmente en un grado significativo una vez que se destruye, los meniscos adultos dañados se han tratado históricamente mediante diversas intervenciones quirúrgicas que incluyen la retirada y sustitución con dispositivos protésicos. En pacientes de más edad, la sustitución de articulación de rodilla es a menudo la opción preferida. Sin embargo, para individuos más jóvenes (aquellos por debajo de 50 o 55 años de edad) la alternativa a sustituir la articulación entera es un trasplante meniscal que usa o bien meniscos protésicos o bien tejido donante para sustituir el menisco dañado. Un problema asociado con el uso de tejido donante para sustitución meniscal es que el menisco es un tejido fibrocartilaginoso denso totalmente impregnado con fibrocondrocitos que son las células responsables de la síntesis, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular. El menisco medial humano es de aproximadamente 4,5 cm de longitud y el menisco lateral es de aproximadamente 3,5 cm de longitud, el grosor de cada uno oscila desde 25 hasta 35 mm (los valores porcinos son similares a los de meniscos humanos). Como el menisco humano es un tejido grueso y denso con células situadas en toda su extensión y especialmente alrededor de la microvasculatura es extremadamente difícil descelularizarlo, especialmente en las regiones centrales, lo que a su vez significa que es difícil preparar un tejido inmunológicamente inerte o descelularizado para trasplante y por tanto hay riesgo de rechazo. En otras palabras hay poca biocompatibilidad y alto riesgo de que el hospedador tenga una reacción inmunológica tanto del heteroinjerto como del xenoinjerto. A fin de proporcionar un implante meniscal biocompatible acelular, se han desarrollado prótesis meniscales artificiales. Sin embargo, un problema asociado con la prótesis meniscal artificial es que no es tan robusta como el tejido meniscal natural y también es deficiente en las propiedades elásticas de los meniscos naturales y por consiguiente las prótesis de este tipo no son tan eficaces en la absorción de impacto como el material natural. Un procedimiento que pudiera descelularizar eficazmente el tejido meniscal donante ofrecería beneficio inmediato al tratamiento de individuos que necesitaran implante/trasplante meniscal. BREVE RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN Según un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para preparar tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de: (i) aplicar ultrasonidos al tejido en una disolución tamponada; (ii) congelar y descongelar el tejido; (iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica; (iv) incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico; (v) repetir las etapas (iii) y (iv); (vi) incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y (vii) lavar el tejido con un agente oxidante; Preferiblemente, la etapa (ii) se puede realizar con anterioridad a la etapa (i), es decir, que el tejido meniscal donante 2   se puede someter al procedimiento de congelación/descongelación con anterioridad al procedimiento de aplicación de ultrasonidos, y no se pretende que el orden de estas dos etapas limite el alcance de la invención. A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta memoria de patente, las palabras "comprenden" y "contienen" y las variaciones de dichas palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende" quieren dar a entender "que incluyen pero no se limitan a", y no se pretende (ni se pone en práctica) excluir otros restos, aditivos, componentes, unidades o etapas. A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta memoria de patente, el singular engloba el plural a menos que el contexto exija otra cosa. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se ha de entender que la memoria de patente considera la pluralidad así como la singularidad, a menos que el contexto exija otra cosa. Rasgos, unidades, características, compuestos, restos o grupos químicos descritos en conjunción con un aspecto, realización o ejemplo particular de la invención se ha de entender que son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en este documento a menos que sean incompatibles con ellos. En una realización de la invención, el procedimiento comprende preparar un tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de: (i) congelar y descongelar el tejido; (ii) incubar el tejido en una disolución hipotónica; (iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico; (iv) repetir las etapas (ii) y (iii); (v) incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y (vi) lavar el tejido con un agente oxidante; En esta realización de la invención se omite la etapa de aplicar ultrasonidos al tejido en una disolución tamponada. Se ha encontrado que el procedimiento de la presente invención se puede realizar con éxito sin la etapa de aplicación de ultrasonidos, pero se piensa que dicha etapa permite una mejor recelularización sobre la implantación una vez que se descelulariza el tejido meniscal. Por lo tanto, es una etapa opcional y preferida en la invención pero una etapa que se puede necesitar para mejorar la posterior recelularización y por lo tanto en alguna ocasión se llevará a cabo como parte del procedimiento de la presente invención. Se apreciará que el menisco se puede obtener extrayendo la totalidad o una porción de un menisco medial o lateral de una articulación de rodilla de un donante alogénico o xenogénico. Preferiblemente el receptor del menisco preparado es un ser humano, como alternativa el receptor puede ser de cualquier otra especie que requiera un implante meniscal como resultado de un daño o una degeneración de dicho tejido. Un xenoinjerto o xenotrasplante es un trasplante de tejido desde un donante de una especie a un receptor de otra especie. A veces también se usan los términos heteroinjerto o heterotrasplante, mientras los términos homoinjerto o aloinjerto se refieren a trasplante en la misma especie. En la presente invención, cuando el receptor es un ser humano, el donante es preferiblemente un ser humano o cualquier otro mamífero que tenga menisco de propiedades fisiológicas parecidas aproximadamente. Preferiblemente el tejido meniscal donante es de origen indistintamente humano o porcino. Como se ha indicado anteriormente en este documento, se puede conseguir la descelularización en ausencia de aplicación de ultrasonidos pero cuando se incluye en el procedimiento de la presente invención, la etapa de aplicación de ultrasonidos se lleva a cabo en disolución salina tamponada de fosfato (PBS) o cualquier otra disolución tampón fisiológicamente aceptable. Preferiblemente, la energía ultrasónica es de impulsos, un régimen típico es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 segundos de conexión y 0,5, 1 o 2 segundos de desconexión, aunque se apreciará que los tiempos exactos de los impulsos no tienen intención de limitar el alcance de la invención. Preferiblemente, la potencia ultrasónica está entre 100-700 vatios,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de: (i) congelar y descongelar el tejido; (ii) incubar el tejido en una disolución hipotónica; (iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico; (iv) repetir las etapas (ii) y (iii); (v) incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y (vi) lavar el tejido con un agente oxidante. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además la etapa de aplicar ultrasonidos al tejido en una disolución tamponada ya sea antes o después de la etapa (i). 3. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el menisco se puede obtener retirando la totalidad o una porción de un menisco medial o lateral de una articulación de rodilla de un donante alogénico o xenogénico y en el que opcionalmente el donante es humano o porcino. 4. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de congelación y descongelación comprende congelar el tejido entre -10 y -80ºC y en el que opcionalmente la etapa de congelación dura entre 2-24 horas y la etapa posterior de descongelación dura 2, 3, o 4 horas hasta que el tejido se deshiela. 5. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el procedimiento de la etapa de congelación y descongelación se lleva a cabo al menos una o más veces en ausencia de un tampón hipotónico y se repite una o más veces mientras el tejido está sumergido en una disolución tampón hipotónica, y en el que opcionalmente la disolución tampón hipotónica es disolución de Tris 10 mM a un pH de 8,0 e incluye EDTA y aprotinina. 6. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de incubación con una disolución hipotónica de la etapa (ii) comprende un lavado hipotónico en dos fases a temperaturas que se elevan gradualmente y que además incluyen opcionalmente una etapa de incubación con tercera fase que comprende incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende adicionalmente un detergente aniónico y en la que opcionalmente la incubación dura entre 1-3 días y la temperatura de incubación está por encima de la de la etapa de incubación en la segunda fase. 7. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente que incluye además la etapa de lavar el tejido en una disolución tampón que comprende un agente quelante después de la etapa de incubación y en el que opcionalmente la disolución tampón es PBS y el agente quelante es EDTA. 8. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de incubar el tejido con una disolución que comprende una o más enzimas nucleasa está después de las etapas de incubación repetida. 9. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el agente oxidante en la etapa de lavar el tejido con un agente oxidante es ácido peroxiacético (C2H4O3) o ácido peracético (PAA) y en el que opcionalmente la concentración de PAA está en el intervalo de 0,01 - 0,5% v/v. 10. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente que comprende además la etapa de un lavado de incubación multi-fase en PBS a temperaturas decrecientes después del lavado del tejido en presencia de un agente oxidante. 11. Un producto que comprende tejido meniscal que se puede obtener por el procedimiento de cualquier reivindicación precedente para uso en un tejido de trasplante. 12. Un tejido meniscal que se puede obtener por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso como un tejido de trasplante. 13. Un producto meniscal según una u otra de las reivindicaciones 12 o 13 caracterizado por la ausencia (100%) o sustancial ausencia (90%) de células en el área central del tejido meniscal. 14. Un producto meniscal según una u otra de las reivindicaciones 12 o 13 caracterizado por un contenido en ADN genómico (ADNg) entre 0 y 20 ng/mg.   11   12   13   14     16   17   18   19