Método de selección de un polipéptido que se une a un antígeno diana específico,

comprendiendo dicho método:

(A) generar una composición que comprende una pluralidad de polipéptidos, en la que dichos polipéptidos comprenden un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que:

(i) CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22), en la que G está en la posición 26 y X1 está en la posición 28 según el sistema de numeración Kabat; en la que X1 se selecciona entre S e Y; en la que X2 se selecciona entre Y y S; en la que X3 se selecciona entre Y y S; en la que X4 se selecciona entre Y y S; y en la que X5 se selecciona entre Y y S;

(ii) CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G 10 (SEQ ID NO: 23), en la que X1 está en la posición 50 según el sistema de numeración Kabat; en la que X1 se selecciona entre Y y S; en la que X2 se selecciona entre Y y S; en la que X3 se selecciona entre Y y S; en la que X4 se selecciona entre Y y S; en la que X5 se selecciona entre Y y S; y en la que X6 se selecciona entre Y y S; y

(iii) CDRH3 comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:24), en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 50% Y, 25% S, y 25% G; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 50% Y, 25% S, y 25% G, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F;

(b) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:26), en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 25% Y, 50% S, y 25% R; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 25% Y, 50% S, y 25% R, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F;

(c) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-30 X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:27), en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 38% Y, 25% S, 25% G, y 12% R; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 38% Y, 25% S, 25% G, y 12% R, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F; o

(d) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:28), en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se 40 seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1% D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1% V, y 1% W; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1% D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 45 1% V, y 1% W, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F; o

(e) CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos: XI-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19, en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-50 X17 se seleccionan entre S y uno de A, C, F, G, I, L, N, P, R, T, W, o Y, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre F, L, I, y M.

(B) seleccionar uno o más polipéptidos de la composición que se unen a un antígeno diana;

(C) aislar dicho uno o más polipéptidos que se unen al antígeno diana de los polipéptidos que no se unen al antígeno diana; y

(D) identificar dicho uno o más polipéptidos que se unen al antígeno diana que tienen una afinidad deseada para el antígeno diana;

en el que dicho antígeno diana es HER2.

Polipéptidos de unión y usos de los mismos.

REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud es una solicitud no provisional que reivindica la prioridad de la U.S. Serie No. 60/742, 185 presentada el 2 de diciembre y la U.S. Serie No. 60/805, 553 presentada el 22 de junio del 2006.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a variantes de CDR diversificadas utilizando repertorios de aminoácidos altamente limitados y bibliotecas que comprenden una pluralidad de dichas secuencias. La presente invención también se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden estas variantes de CDR. La presente invención se refiere a métodos y composiciones útiles para identificar polipéptidos de unión nuevos que se pueden utilizar terapéuticamente o como reactivos.

ANTECEDENTES

La tecnología de expresión en fagos ha proporcionado una herramienta potente para la generación y selección de nuevas proteínas que se unen a un ligando, tal como un antígeno. Utilizando las técnicas de expresión en fagos se permite la generación de amplias bibliotecas de variantes de proteínas que se pueden clasificar rápidamente por las secuencias que se unen a un antígeno diana con afinidad elevada. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos variantes se fusionan a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de cubierta viral, tal como la proteína del gen III o la proteína del gen VIII. Se han desarrollado sistemas de expresión en fagos monovalentes en los que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína o el polipéptido se fusiona a una secuencia de ácido nucleico que codifica una parte de la proteína del gen III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990) ; Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991) ) . En un sistema de expresión en fagos monovalentes, la fusión génica se expresa a niveles bajos y también se expresan proteínas del gen III de tipo salvaje, de manera que se mantiene la infectividad de las partículas. En muchas patentes se han descrito métodos de generación de bibliotecas de péptidos y cribado de estas bibliotecas (por ejemplo, patente de Estados Unidos No. 5, 723, 286, patente de Estados Unidos No. 5, 432, 018, patente de Estados Unidos No. 5, 580, 717, patente de Estados Unidos No. 5, 427, 908 y patente de Estados Unidos No. 5, 498, 530) .

La demostración de la expresión de péptidos en la superficie de fagos filamentosos y la expresión de fragmentos de anticuerpo funcionales en el periplasma era importante en el desarrollo de bibliotecas de expresión en fagos de anticuerpos. (Smith et al., Science (1985) , 228:1315; Skerra and Pluckthun, Science (1988) , 240:1038) . Se han preparado bibliotecas de anticuerpos o polipéptidos de unión a antígeno de varias maneras mediante la alteración de un único gen mediante la inserción de secuencias de ADN aleatorias o mediante la clonación de una familia de genes relacionados. Se han descrito métodos para expresar anticuerpos

o fragmentos de unión a antígeno utilizando la expresión de fagos en la patente de Estados Unidos Nos. 5, 750, 373, 5, 733, 743, 5, 837, 242, 5, 969, 108, 6, 172, 197, 5, 580, 717, y 5, 658, 727. A continuación, la biblioteca se criba por la expresión de anticuerpos o proteínas de unión a antígeno con las características deseadas.

La tecnología de expresión de fagos presenta varias ventajas sobre los métodos convencionales de hibridoma y recombinantes para la preparación de anticuerpos con las características deseadas. Esta tecnología permite el desarrollo de amplias bibliotecas de anticuerpos con diversas secuencias en menos tiempo y sin la utilización de animales. La preparación de hibridomas o la preparación de anticuerpos humanizados pueden requerir fácilmente varios meses de preparación. Además, dado que no se requiere inmunización, se pueden generar bibliotecas de anticuerpos en fagos para antígenos que son tóxicos o presentan una antigenicidad baja (Hogenboom, Immunotechniques (1988) , 4:1-20) . Las bibliotecas de expresión en fagos también se pueden utilizar para generar e identificar anticuerpos humanos nuevos.

Los anticuerpos se han convertido en muy útiles como agentes terapéuticos para una amplia variedad de afecciones. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados para Her-2, un antígeno tumoral,

útiles en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Otros anticuerpos, tales como un anticuerpo anti-IFN-, son útiles en el tratamiento de afecciones inflamatorias, tales como la enfermedad de Crohn. Se han utilizando las bibliotecas de expresión en fagos para generar anticuerpos humanos de humanos inmunizados y no inmunizados, secuencias de la línea germinal, o repertorios de Ig de células B intactas (Barbas & Burton, Trends Biotech (1996) , 14:230; Griffiths et al., EMBO J. (1994) , 13:3245; Vaughan et al., Nat. Biotech. (1996) , 14:309; Winter EP 0368 684 B1) . Se han generado bibliotecas de unión a antígeno intactas o no inmunes utilizando un conjunto de tejidos linfoidales. Algunas de estas bibliotecas están disponibles comercialmente, tales como las desarrolladas por Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996) ; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57 (1999) ) . Sin embargo, muchas de estas bibliotecas presentan una diversidad limitada.

La capacidad de identificar y aislar anticuerpos de afinidad elevada de una biblioteca de expresión en fagos es importante para aislar anticuerpos humanos nuevos para uso terapéutico. Se cree, tradicionalmente, que el aislamiento de anticuerpos de afinidad elevada de una biblioteca depende, por lo menos en parte, del tamaño de la biblioteca, la eficacia de producción en células bacterianas y la diversidad de la biblioteca. Véase, por ejemplo, Knappik et al., J. Mol. Biol. (1999) , 296:57. El tamaño de la biblioteca disminuye por la ineficiencia en la producción debido a un plegamiento incorrecto del anticuerpo o proteína de unión a antígeno y la presencia de codones de parada. La expresión en células bacterianas se puede inhibir si el anticuerpo o el dominio de unión a antígeno no están correctamente plegados. La expresión se puede mejorar mediante la mutación de residuos en giros en la superficie de la interzona variable/constante o en residuos de CDR seleccionados. (Deng et al., J. Biol. Chem. (1994) , 269:9533, Ulrich et al., PNAS (1995) , 92:11907-11911; Forsberg et al., J. Biol. Chem. (1997) , 272 :12430) . La secuencia de la región armazón es un factor en la proporción para el plegamiento correcto cuando se producen bibliotecas de fagos de anticuerpos en células bacterianas.

La generación de una biblioteca diversa de anticuerpos o proteínas de unión a antígeno también es importante para el aislamiento de anticuerpos de afinidad elevada. Se han generado bibliotecas con diversificación en CDR limitadas utilizando una variedad de estrategias. Véase, por ejemplo, Tomlinson, Nature Biotech. (2000) , 18:989-994. Las regiones CDR3 son de interés en parte porque se ha encontrado que a menudo participan en la unión a antígeno. Las regiones CD3 en la cadena pesada varían ampliamente de tamaño, secuencia y conformación estructural.

Otros también han generado diversidad mediante la aleatorización de regiones de CDR de las cadenas pesada y ligera variable utilizando los 20 aminoácidos en cada posición. Se creyó que utilizando los 20 aminoácidos se daría lugar a una amplia diversidad de secuencias de anticuerpos variantes y aumentaría la posibilidad de identificar nuevos anticuerpos (Barbas, PNAS 91:3809 (1994) ; Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995) ; Jackson, J.R., J. Immunology, 154:3310 (1995) y Hawkins, RE, J. Mol. Biology, 226:889 (1992) ) .

Han habido también intentos de crear diversidad mediante la limitación del grupo de sustituciones de aminoácidos en algunas CDR para reflejar la distribución de aminoácidos en anticuerpos naturales. Véase, Garrard & Henner, Gene (1993) , 128: 103; Knappik et al., J. Mol. Biol. (1999) , 296:57. Sin embargo, estos intentos han tenido un éxito variable y no se han aplicado de una manera sistemática y cuantitativa. Crear la diversidad en las regiones CDR a la vez que minimizar el número de cambios de aminoácidos ha sido un desafío. Además, en algunos casos, una vez se ha generado una primera biblioteca según un grupo de criterios, puede ser deseable aumentar adicionalmente la diversidad de la primera biblioteca. Sin embargo, esto requiere que la primera biblioteca tenga una diversidad... [Seguir leyendo]

1. Método de selección de un polipéptido que se une a un antígeno diana específico, comprendiendo dicho método:

(A) generar una composición que comprende una pluralidad de polipéptidos, en la que dichos polipéptidos comprenden un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que:

(i) CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22) , en la que G está en la posición 26 y X1 está en la posición 28 según el sistema de numeración Kabat; en la que X1 se selecciona entre S e Y; en la que X2 se selecciona entre Y y S; en la que X3 se selecciona entre Y y S; en la que X4 se selecciona entre Y y S; y en la que X5 se selecciona entre Y y S;

(ii) CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 23) , en la que X1 está en la posición 50 según el sistema de numeración Kabat; en la que X1 se selecciona entre Y y S; en la que X2 se selecciona entre Y y S; en la que X3 se selecciona entre Y y S; en la que X4 se selecciona entre Y y S; en la que X5 se selecciona entre Y y S; y en la que X6 se selecciona entre Y y S; y

(iii) CDRH3 comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:24) , en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 50% Y, 25% S, y 25% G; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 50% Y, 25% S, y 25% G, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F;

(b) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:26) , en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 25% Y, 50% S, y 25% R; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 25% Y, 50% S, y 25% R, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F;

(c) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:27) , en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 38% Y, 25% S, 25% G, y 12% R; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 38% Y, 25% S, 25% G, y 12% R, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F; o

(d) la secuencia de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:28) , en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X6 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1% D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1% V, y 1% W; en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X7-X17 se seleccionan de un grupo de aminoácidos en una proporción molar de 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1% D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1% V, y 1% W, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre I, M, L, y F; o

(e) CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos: XI-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19, en la que X1 está en la posición 95 según el sistema de numeración Kabat, y en la que los aminoácidos en cada una de las posiciones X1-X17 se seleccionan entre S y uno de A, C, F, G, I, L, N, P, R, T, W, o Y, o no están presentes; en la que X18 se selecciona entre G y A; y en la que X19 se selecciona entre F, L, I, y M.

(B) seleccionar uno o más polipéptidos de la composición que se unen a un antígeno diana;

(C) aislar dicho uno o más polipéptidos que se unen al antígeno diana de los polipéptidos que no se unen al antígeno diana; y

(D) identificar dicho uno o más polipéptidos que se unen al antígeno diana que tienen una afinidad deseada para el antígeno diana;

en el que dicho antígeno diana es HER2.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que los polipéptidos son anticuerpos.

3. Método, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los polipéptidos comprenden además un dominio variable de cadena ligera en el que

CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID NO:25) ; en la que X1 está en la posición 91 y se selecciona entre Y, H y S; X2 se selecciona entre Y y S; X3 se selecciona entre Y, S y T; X4 se selecciona entre Y, S y T; y X5 se selecciona entre S, P e Y.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo método comprende proporcionar una biblioteca que comprende la pluralidad de polipéptidos, en el que la biblioteca comprende por lo menos 1 x 104 polipéptidos distintos.

5. Método, según la reivindicación 4, en el que la biblioteca comprende por lo menos 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, ó 1 x 108 polipéptidos distintos.

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo método comprende construir una biblioteca de partículas de fago o fagémido que expresan la pluralidad de polipéptidos; poner en contacto la biblioteca de partículas con el antígeno diana; y separar las partículas que se unen de las que no se unen al antígeno diana.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo método comprende:

(a) aislar uno o más polipéptidos que se unen específicamente al antígeno diana al poner en contacto una biblioteca que comprende la pluralidad de polipéptidos con un antígeno diana inmovilizado bajo condiciones adecuadas para la unión;

(b) separar dichos uno o más polipéptidos que se unen específicamente al antígeno diana de los polipéptidos que no se unen específicamente al antígeno diana, y recuperar dichos uno o más polipéptidos que se unen específicamente al antígeno diana para obtener una subpoblación enriquecida en dichos uno o más polipéptidos que se unen específicamente al antígeno diana; y

(c) opcionalmente, repetir las etapas (a) - (b) por lo menos dos veces, utilizando cada repetición la subpoblación enriquecida en dichos uno o más polipéptidos que se unen específicamente al antígeno diana obtenida de la ronda previa de selección.

Figura 2 Figura 3

Frecuencia LC

Figura 4

Frecuencia HC

Figura 5

Figura 9A: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas YSGR-A, YSGR-B, YSGR-C e YSGR-D. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C,

S = G/C, Y = T/C, R = A/G y N =A/T/G/C) . La notación “XXX” representa codones que codifican Tyr/Ser/Gly en

una proporción molar de 50/25/25, respectivamente.

Figura 9B: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas YSGR-B. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = T/C, R = A/G y N =A/T/G/C) . La notación “XXX” representa codones que codifican Tyr/Ser/Arg en una proporción molar de 25/50/25, respectivamente.

Figura 9C: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas YSGR-C. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y =

T/C, R = A/G y N =A/T/G/C) . La notación “XXX” representa codones que codifican Tyr/Ser/Gly/Arg en una

proporción molar de 38/25/25/12, respectivamente.

Figura 9D: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas YSGR-D. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = T/C, R = A/G y N =A/T/G/C) . La notación “XXX” representa codones que codifican Tyr/Ser/Gly/Arg/Ala/Asp/Glu/Phe/His/Ile/Lys/Leu/Met/Asn/Pro/Gln/Thr/Val/Trp en una proporción molar de 20/26/26/13/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1, respectivamente.

Figura 11A Clones de unión a HER2

Figura 11B

Figura 19A Figura 19B

Figura 20A: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SAH3, SCH3, SFH3, SGH3, SIH3, SLH3, SNH3, SPH3, SRH3, STH3, SWH3 y SYH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20B: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SCH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20C: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SFH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20D: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SGH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20E: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SIH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20F: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SLH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20G: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SNH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20H: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SPH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20I: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SRH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20J: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas STH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20L: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SYH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 20K: Oligonucleótidos mutagénicos utilizados en la construcción de bibliotecas SWH3. Las degeneraciones del ADN equimolar se representan en el código IUB (W = A/T, K = G/T, M = A/C, S = G/C, Y = C/T, R = A/G) .

Figura 21A Figura 21B Figura 22

Figura 24A Figura 24B Figura 25 Figura 26A Figura 26B

Figura 28 Figura 29