Polipéptido aislado con actividad de mejora celulolítica, y con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%,

y más preferiblemente al menos 95% de identidad con los aminoácidos 20 a 326 de la SEC ID nº: 2.

Polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que los codifican

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos

aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos.

Descripción de las técnicas relacionadas

[0002] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unida de manera covalente por beta-1, 4-enlaces. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta-unidos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares aleatorios, abriéndolo para atacar con celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa hidrosoluble

beta-1, 4-unido. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.

La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de cantidades grandes de materia prima, la conveniencia de evitar quema o vertido de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, brotes herbáceos y desperdicios sólidos municipales se han

considerado como materias primas para producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol.

Sería ventajoso en la técnica para mejorar la conversión de materias primas celulósicas.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos aislados con actividad de mejora celulolítica y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos para mejorar la conversión de materias primas celulósicas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere en un primer aspecto a polipéptidos aislados con actividad de mejora celulolítica y con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95% de identidad con los aminoácidos 20 a 326 de la SEC ID nº: 2 .La presente invención se refiere en un segundo aspecto a polinucleótidos

aislados que codifican los polipéptidos con actividad de mejora celulolítica del primer aspecto.

La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped recombinantes comprendiendo los polinucleótidos.

45 [0008] La presente invención también se refiere a métodos para producir tal polipéptido con actividad de mejora celulolítica comprendiendo (a) cultivo de una célula huésped recombinante comprendiendo una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

50 [0009] La presente invención también se refiere a una composición detergente comprendiendo un polipéptido con actividad de mejora celulolítica según la reivindicación 1, una actividad celulolítica y un tensioactivo.

Breve descripción de las figuras

55 [0010] Las figuras 1A y 1 B muestran la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una polipéptido de Thielavia terrestris NRRL 8126 GH61B con actividad de mejora celulolítica (SEC ID nº: 1 y 2, respectivamente) . Intrones predichos están en cursiva. El péptido señal predicho está subrayado. La figura 2 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de un polipéptido de

60 Thielavia terrestris NRRL 8126 GH61C con actividad de mejora celulolítica (SEC ID nº: 3 y 4, respectivamente) . Intrones predichos están en cursiva. El péptido señal predicho está subrayado. La figura 3 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de un polipéptido de Thielavia terrestris NRRL 8126 GH61 D con actividad de mejora celulolítica (SEC ID nº: 5 y 6, respectivamente) . Intrones predichos están en cursiva. El péptido señal predicho está subrayado.

La figura 4 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de un polipéptido de Thielavia terrestris NRRL 8126 GH61 E con actividad de mejora celulolítica (SEC ID nº: 7 y 8, respectivamente) . El péptido señal predicho está subrayado. La figura 5 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de un polipéptido Thielavia terrestris NRRL 8126 GH61 G con actividad de mejora celulolítica (SEC ID nº: 9 y 10, respectivamente) . El péptido señal predicho está subrayado. La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pAILo1. La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pBANe10. La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pAILo2. La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pPH27. La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pPH29. La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pPH28. La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pEJG120. La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pEJG111. La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pEJG112. La Figura 15 muestra un mapa de restricción de pTter61C. La Figura 16 muestra un mapa de restricción de pTter61D. La Figura 17 muestra un mapa de restricción de pTter61E. La Figura 18 muestra un mapa de restricción de pTter61G. La Figura 19 muestra un mapa de restricción de pEJG108. La Figura 20 muestra un mapa de restricción de pAILo24. La Figura 21 muestra un mapa de restricción de pAILo28. La Figura 22 muestra un mapa de restricción de pMJ04. La Figura 23 muestra un mapa de restricción de pMJ06. La Figura 24 muestra un mapa de restricción de pMJ09. La Figura 25 muestra un mapa de restricción de pEmY10. La Figura 26 muestra un mapa de restricción de pSMAI155. La Figura 27 muestra un mapa de restricción de pEJG110. La Figura 28 muestra un mapa de restricción de pEJG114. La Figura 29 muestra un mapa de restricción de pCW076. La Figura 30 muestra un mapa de restricción de pCW078. La Figura 31 muestra un mapa de restricción de pEJG97. Las Figuras 32A e 32B muestran la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 75 y 76, respectivamente) . El péptido señal predicho está subrayado e intrones predichos están en cursiva. La Figura 33 muestra un mapa de restricción de pEJG107. La Figura 34 muestra el efecto de un polipéptido Thielavia terrestris GH61 B con actividad de mejora celulolítica (1 mg/g PCS) en la hidrólisis de PCS (1% p/v) por caldo de fermentación de Trichoderma reesei que expresa actividad y una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (5 mg/g PCS) a 50-60°C. La Figura 35 muestra el efecto de un polipéptido de Thielavia terrestris GH61B con actividad de mejora celulolítica (1 mg/g PCS) en la hidrólisis de PCS (1% p/v) por caldo de fermentación de Trichoderma reesei que expresa actividad celulolítica de caldo de fermentación y una Aspergillus fumigatus (5 mg/g PCS) a 50°C. La Figura 36 muestra conversión de celulosa por Tr/AoBG sola o Tr/AoBG complementada con polipéptidos de Thielavia terrestris GH61 con actividad celulolítica a 50°C, pH 5, 0 durante 115 horas.

Definiciones

El término "actividad de mejora celulolítica" se define aquí como una actividad biológica que aumenta la hidrólisis de un material celulósico por proteínas con actividad celulolítica. Para fines de la presente invención, actividad de mejora celulolítica se determina por medición del aumento en azúcares reductores de la hidrólisis de un material celulósico por proteína celulolítica bajo las siguientes condiciones: 5, 0 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS durante 5-7 días a 50°C en presencia y ausencia de 0, 01-2, 5 mg de actividad de mejora celulolítica por g de celulosa en PCS en comparación con una hidrólisis de control con carga igual de proteína total sin actividad de mejora celulolítica (5, 01-7, 5 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS) . En un aspecto preferido, una mezcla de muestra... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de mejora celulolítica, y con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95% de identidad con los aminoácidos 20 a 326 de la SEC ID nº: 2.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que se codifica por el polinucleótido contenido en el plásmido pEJG120 que está contenido en E. coli NRRL B-30699.

3. Polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Construcción de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucleótido según la reivindicación 3 unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

5. Vector de expresión recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 4.

6. Célula huésped recombinante comprendiendo la construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 4.

7. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo (a) cultivo de una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

8. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo (a) cultivo de una célula huésped comprendiendo una construcción de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

9. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal comprendiendo un polinucleótido que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

10. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

11. Método para degradación o conversión de un material celulósico, comprendiendo: tratamiento del material celulósico con una cantidad eficaz de una proteína celulolítica en presencia de una cantidad eficaz del polipéptido con actividad mejoradota celulolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la presencia del polipéptido con actividad de mejora celulolítica aumenta la degradación del material celulósico en comparación con la ausencia del polipéptido con actividad de mejora celulolítica.

12. Método según la reivindicación 11, donde el material celulósico se selecciona del grupo que consiste en material herbáceo, residuo agrícola, residuo de silvicultura, desperdicios sólidos municipales, papel usado y pulpa y residuo de fábrica de papel.

13. Método según la reivindicación 11 o 12, donde una o más enzimas celulolíticas se seleccionan del grupo que consiste en una celulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa y beta-glucosidasa.

14. Composición detergente comprendiendo un polipéptido con actividad de mejora celulolítica según la reivindicación 1, una actividad celulolítica, y un tensioactivo.

15. Composición según la reivindicación 14, comprendiendo además una o más enzimas tal como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, y/o peroxidasa.