Plásmido que tiene tres unidades transcripcionales completas y composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmunitaria contra el VIH.

Una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra elvirus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un huésped vertebrado,

consistiendo dicha composicióninmunogénica en:

(a) un primer plásmido de ADN que consiste en una sola unidad transcripcional que consiste en una secuenciade nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión gag-pol del VIH, en la que dicha única unidadtranscripcional está unida operativamente a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal depoliadenilación;

(b) un segundo plásmido de ADN que consiste en:

(i) una primera unidad transcripcional que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica unpolipéptido de fusión nef-tat-vif del VIH unido operativamente a elementos reguladores que incluyen unprimer promotor y una primera señal de poliadenilación;

(ii) una segunda unidad transcripcional que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica unpolipéptido de envuelta del VIH unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un segundopromotor y una segunda señal de poliadelinación; en la que cada uno de dichos primer y segundopromotores derivan de diferentes unidades transcripcionales; y en la que cada una de dichas primera ysegunda señales de poliadelinación derivan de diferentes unidades transcripcionales; y en la que el sentidode la transcripción de dicha primera unidad transcripcional está en el sentido opuesto al sentido de latranscripción de dicha segunda unidad transcripcional; o en la que el sentido de la transcripción de dichaprimera unidad transcripcional está en el mismo sentido que el sentido de la transcripción de dicha segundaunidad transcripcional y dichas primera y segunda unidades transcripcionales están separadas por unaregión espaciadora de al menos un par de kilobases;

(c) un tercer plásmido de ADN que consiste en un ADN plasmídico que codifica un adyuvante; y

(d) al menos uno de un diluyente, vehículo o agente facilitador de la transfección farmacéuticamenteaceptables.

Plásmido que tiene tres unidades transcripcionales completas y composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmunitaria contra el VIH

Campo de la invención

La presente invención se refiere a plásmidos, a composiciones inmunogénicas y a procedimientos para mejorar las respuestas inmunitarias profilácticas y terapéuticas contra antígenos.

Antecedentes de la invención

La inmunización usando composiciones inmunogénicas basadas en ADN plasmídico es una herramienta poderosa que es útil para desarrollar estrategias para prevenir o tratar enfermedades infecciosas o en el tratamiento de procesos de enfermedades en curso. La inmunización con ADN plasmídico se ha sometido ampliamente a ensayo en modelos animales donde se ha encontrado que es eficaz induciendo respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales contra una amplia diversidad de agentes infecciosos y antígenos tumorales. Véase Donnelly JJ, y col., Ann. Rev. Immunol.; 15: 617-48 (1997) ; Iwasaki A, y col., J Immunol 158 (10) : 4591-601 (1997) ; Wayne, C. L y Bennett M., Crit. Rev. Immunol., 18: 449-484 (1998) .

Una ventaja importante de la inmunización con ADN plasmídico es que los genes pueden clonarse, modificarse y situarse en un posible vector de expresión de ADN plasmídico de tal manera que permite realizar, de manera pertinente, modificaciones post-transcripcionales, niveles de expresión, transito intracelular y presentación de antígenos apropiados. Los vectores de ADN plasmídico, útiles para la inmunización con ADN, son similares a los empleados para la administración de genes indicadores o terapéuticos. La inmunización basada en ADN plasmídico utiliza la maquinaria celular del sujeto para generar la proteína extraña y estimula el sistema inmunitario del sujeto para crear una respuesta inmunitaria frente al antígeno de proteína. Dichos vectores de ADN plasmídico generalmente contienen elementos reguladores transcripcionales eucariotas que son fuertes elementos promotores/potenciadores virales que dirigen altos niveles de expresión de genes en una amplia variedad de células huésped y una secuencia de poliadenilación para garantizar la terminación apropiada del ARNm expresado. Aunque los elementos reguladores virales son ventajosos para su uso en vectores de ADN plasmídico, el uso de vectores virales no modificados para expresar los genes pertinentes puede provocar problemas de seguridad y técnicos no encontrados con el ADN plasmídico.

Sin embargo, los diseños actuales de ADN plasmídico, limitan la expresión de genes múltiples a partir de una estructura de vector en una sola célula diana. Por lo tanto, para transferir y expresar genes múltiples, se requiere la co-transfección de las células diana con distintos plásmidos. Cuando las células deben co-transfectarse con plásmidos múltiples, es difícil conseguir una expresión óptima de todos los genes codificados, especialmente cuando el plásmido va a usarse in vivo. Los intentos previos para superar estas limitaciones y expresar dos o más genes incluyen el uso de lo siguiente: vectores virales, transcritos de corte y empalme alternativamente múltiples de ADN proviral, fusión de genes, vectores bicistrónicos que contienen secuencias IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) de virus y plásmidos de expresión duales. Véase Conr y R. M. y col., Gene Therapy. 3 (1) : 67-74, (1996) ; Chen TT. y col., Journal of Immunology. 153 (10) : 4775-87, (1994) ; Ayyavoo V. y col., AIDS. 14 (1) : 1-9, (2000) ; Amara R. R. y col., Vaccine. 20 (15) : 1949-55, (2002) ; Singh G, y col., Vaccine 20: 1400-1411 (2002) .

Ninguno de los diseños de plásmidos existentes han resuelto el problema de proporcionar un ADN plasmídico que sea adecuado para expresar más de dos fases de lectura abierta independientes en composiciones inmunogénicas humanas. En el caso de vectores bicistrónicos, en muchos casos, sólo se expresa con fuerza el primer gen transcrito aguas arriba del IRES bien desde un plásmido o bien desde un vector retroviral. Véase Sugimoto Y., y col., Hum. Gen. Ther. 6: 905-915 (1995) ; Mizoguchi H, y col., Mol. Ther. 1: 376-382 (2000) . Por otro lado, los casetes de expresión dual, tienen mejor resultado. Por ejemplo, se ha observado que, cuando se compara con plásmidos individuales, la co-administración de ADNc para B7-1 y antígeno carcinoembrionario humano (ACH) con un solo plásmido que tiene dos casetes independientes da como resultado respuestas inmunitarias muy superiores. Véase Conr y R.M. y col., Gene Therapy. 3 (1) : 67-74, (1996) . Sin embargo, en este caso los dos casetes independientes implicados consisten en secuencias homólogas promotoras del CMVH y de poli-adenilación de la hormona del crecimiento bovina (HCB) . La presencia de secuencias homólogas dentro de un plásmido hace que el plásmido sea inadecuado para su uso en composiciones inmunogénicas basadas en ADN, porque la presencia de secuencias homólogas dentro de la estructura del plásmido aumenta la posibilidad de recombinación entre las secuencias repetidas y da como resultado la inestabilidad del vector.

Otra restricción que se afronta cuando se diseña un vector de ADN plasmídico para su uso en una composición inmunogénica humana tiene que ver con el tamaño y la organización del plásmido. Dado que se añaden unidades transcripcionales a un plásmido, puede surgir interferencia entre unidades transcripcionales, por ejemplo, en forma de impedimento estérico. El complejo de transcripción de ARN de las células debe ser capaz de unirse a los sitios múltiples sobre un plásmido de unidad politranscripcional, desenrollar el ADN y transcribir eficazmente los genes. Simplemente haciendo que el plásmido sea mayor no es necesariamente la mejor solución por diversas razones que incluyen inestabilidad del plásmido, dificultad en la fabricación del plásmido y, lo que es más importante,

consideraciones de dosificación. Para diseñar un vector mejorado de unidad transcripcional múltiple de ADN plasmídico, ha de tenerse en cuenta la ubicación de los genes, la separación y el sentido de la transcripción de las fases de lectura abierta, los niveles de expresión, la facilidad de fabricación, la seguridad y la dosis final del vector necesaria para inmunizar al sujeto.

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de diseños creativos de vectores no virales, de ADN plasmídico, para su uso en la expresión de proteínas múltiples a partir de patógenos complejos como el VIH, en el que se requiere una amplia respuesta inmunitaria contra muchas proteínas. Además, existe una necesidad de composiciones inmunogénicas polivalentes, basadas en ADN, que puedan dirigir la expresión de altos niveles de genes múltiples del VIH dentro de una sola célula.

Sumario de la invención

En una realización, la presente invención proporciona un plásmido de ADN que comprende: (a) una primera unidad transcripcional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un primer promotor y una primera señal de poliadenilación;

(b) una segunda unidad transcripcional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un segundo promotor y una segunda señal de poliadenilación; (c) una tercera unidad transcripcional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un tercer polipéptido unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un tercer promotor y una tercera señal de poliadenilación; en el que cada dicho primer, segundo y tercer promotor deriva de diferentes unidades transcripcionales; y en el que cada dicha primera, segunda y tercera señal de poliadenilación deriva de diferentes unidades transcripcionales. En otra realización de la invención, el primer, segundo y tercer polipéptido se expresa en una célula eucariota.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmunitaria contra antígenos seleccionados en un huésped vertebrado, comprendiendo la composición inmunogénica: (a) un plásmido de ADN que comprende (i) una primera unidad transcripcional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un primer promotor y una primera señal de poliadenilación; (ii) una segunda unidad transcripcional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido unido operativamente a... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un huésped vertebrado, consistiendo dicha composición inmunogénica en:

(a) un primer plásmido de ADN que consiste en una sola unidad transcripcional que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión gag-pol del VIH, en la que dicha única unidad transcripcional está unida operativamente a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación;

(b) un segundo plásmido de ADN que consiste en:

(i) una primera unidad transcripcional que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión nef-tat-vif del VIH unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un primer promotor y una primera señal de poliadenilación;

(ii) una segunda unidad transcripcional que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de envuelta del VIH unido operativamente a elementos reguladores que incluyen un segundo promotor y una segunda señal de poliadelinación; en la que cada uno de dichos primer y segundo promotores derivan de diferentes unidades transcripcionales; y en la que cada una de dichas primera y segunda señales de poliadelinación derivan de diferentes unidades transcripcionales; y en la que el sentido de la transcripción de dicha primera unidad transcripcional está en el sentido opuesto al sentido de la transcripción de dicha segunda unidad transcripcional; o en la que el sentido de la transcripción de dicha primera unidad transcripcional está en el mismo sentido que el sentido de la transcripción de dicha segunda unidad transcripcional y dichas primera y segunda unidades transcripcionales están separadas por una región espaciadora de al menos un par de kilobases;

(c) un tercer plásmido de ADN que consiste en un ADN plasmídico que codifica un adyuvante; y

(d) al menos uno de un diluyente, vehículo o agente facilitador de la transfección farmacéuticamente aceptables.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que dicho agente facilitador de la transfección es la bupivacaina.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que dichos promotores se seleccionan del grupo que consiste en el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMVH) , el promotor del citomegalovirus simio (CMVS) , el promotor de citomegalovirus murino (CMVM) , el promotor 1 asociado a latencia (LAP1) del virus del herpes simple (VHS) , el promotor del virus simio 40, el promotor del factor de elongación humano 1 alfa y el promotor de desmina especifico de células musculares humanas.

4. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que dichas señales de poliadenilación se seleccionan del grupo constituido por la señal poli (A) de la beta-globina de conejo, la poliA sintética, la poliA de la timidina quinasa del VHS, la poliA de la alfa-globina humana, la poliA de SV40, la poliA de la beta-globina humana, la poliA del poliomavirus y la poliA de la hormona del crecimiento bovina.

5. La composición inmunogénica de la reivindicación 3, en la que dicho promotor sobre dicho primer plásmido es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMVH) .

6. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicha señal de poliadenilación sobre dicho primer plásmido es la señal de poliadenilación poliA de la hormona del crecimiento bovina.

7. La composición inmunogénica de la reivindicación 3, en la que dicho promotor sobre dicho segundo plásmido es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMVH) .

8. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicha primera señal de poliadenilación sobre dicho segundo plásmido es la señal de poliadenilación poliA de SV40.

9. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido de fusión nef-tat-vif del VIH es una proteína de fusión nef, tat, y vif (NTV) expresada a partir de una fusión de los genes nef, tat y vif (ntv) del VIH.

10. La composición inmunogénica de la reivindicación 3, en la que dicho segundo promotor sobre dicho segundo plásmido es el promotor del citomegalovirus simio (CMVS) .

11. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que dicha segunda señal de poliadenilación sobre dicho segundo plásmido es la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (HCB) .

12. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que dicho tercer plásmido de ADN codifica un adyuvante de IL-12.

13. El uso de una composición inmunogénica, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la preparación de un medicamento para inmunizar a un huésped vertebrado contra antígenos seleccionados.