Un compuesto que se une a un receptor mpl, que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la ID.SEC. nº 34.

Péptidos miméticos de trombopoyetina diméricos que se unen al receptor MPL y que tienen actividad trombopoyética

CAMPO DEL INVENTO

En general, el invento se refiere al campo de compuestos, especialmente péptidos y polipéptidos, que tienen actividad trombopoyética. Los compuestos del invento pueden ser utilizados para aumentar la producción de plaquetas o precursores de plaquetas (por ejemplo, megacariocitos) en un mamífero.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

Este invento se refiere a compuestos, especialmente péptidos, que tienen la capacidad de estimular in vitro e in vivo la producción de plaquetas y sus células precursoras, tales como megacariocitos. Antes de discutir la naturaleza de los compuestos del invento, se proporciona lo siguiente como un antecedente relativo a dos proteínas que tienen actividad trombopoyética: la trombopoyetina (TPO) y el factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF; del inglés, megakar y ocyte growth and development factor) .

La clonación de trombopoyetina (TPO) endógena [Lok et al., Nature 369: 568-571 (1.994) ; Bartley et al., Cell 77: 1.117-1.124 (1.994) ; Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11.104-11.108 (1.994) ; de Sauvage et al., Nature

369: 533-538 (1.994) ; Kato et al., Journal of Biochemistr y 119: 229-236 (1.995) ; Chang et al., Journal of Biological Chemistr y 270: 511-514 (1.995) ] ha aumentado rápidamente nuestros conocimientos sobre la megacariopoyesis (producción de megacariocitos) y la trombopoyesis (producción de plaquetas) .

La TPO humana endógena, una proteína glicosilada de 60 a 70 kDa y producida esencialmente en el hígado y el riñón, consiste en 332 aminoácidos [Bartley et al., Cell 77: 1.117-1.124 (1.994) ; Chang et al., Journal of Biological Chemistr y 270: 511-514 (1.995) ]. La proteína está muy conservada entre diferentes especies y presenta un 23 % de homología con la eritropoyetina humana [Gurney et al., Blood 85: 981-988 (1.995) ] en el extremo amínico (aminoácidos 1 a 172 ) [Bartley et al., Cell 77: 1.117-1.124 (1.994) ]. Se ha mostrado que la TPO endógena posee todas las características del regulador biológico esencial de la trombopoyesis. Sus acciones in vitro incluyen la inducción específica de colonias de megacariocitos a partir tanto de células madre hematopoyéticas murinas purificadas [Zeigler et al., Blood 84: 4.045-4.052 (1.994) ] como de células CD34+ humanas [Lok et al., Nature 369: 568-571 (1.994) ; Rasko et al., Stem Cells 15: 33-42 (1.997) ], la generación de megacariocitos con ploidia aumentada [Broudy et al., Blood 85: 402-413 (1.995) ], y la inducción de la maduración terminal de megacariocitos y de la producción de plaquetas [Zeigler et al., Blood 84: 4.045-4.052 (1.994) ; Choi et al., Blood 85: 402-413 (1.995) ]. Por el contrario, oligodesoxinucleótidos antisentido sintéticos hacia el receptor de TPO (c-Mpl) inhiben significativamente la capacidad formadora de colonias de los progenitores megacariocíticos [Methia et al., Blood 82: 1.395-1.401 (1.993) ]. Además, ratones inoperantes (knock-out) para c-Mpl son intensamente trombocitopénicos y presentan deficiencia de megacariocitos [Alexander et al., Blood 87: 2.162-2.170 (1.996) ].

El MGDF humano recombinante (rHuMGDF; Amgen Inc., Thousand Oaks, California, EE.UU.) es otro polipéptido trombopoyético relacionado con la TPO. Se produce usando E. coli. transformada con un plásmido que contiene cDNA que codifica una proteína truncada que abarca el dominio amino-terminal ligante del receptor, de la TPO humana [Ulich et al., Blood 86: 971-976 (1.995) ]. El polipéptido es extraído, vuelto a plegar y purificado, y un grupo polietilenglicol (PEG) es fijado covalentemente al extremo amínico. A la molécula resultante se hace aquí referencia como PEG-rHuMGDF, o MGDF para abreviar.

Mediante diversos estudios en que se usaban modelos animales [T. R. Ulich et al., Blood 86: 971-976 (1.995) ; M. M. Hokom et al., Blood 86: 4.486-4.492 (1.995) ] se han demostrado claramente las eficacias terapéuticas de TPO y MGDF en el trasplante de médula ósea y en el tratamiento de la trombocitopenia, un estado que resulta a menudo de una quimioterapia o una terapia por radiación. Datos preliminares sobre seres humanos han confirmado la utilidad del MGDF para elevar las cuentas de plaquetas en diversos ámbitos [Basser et al., Lancet 348: 1.279-81 (1.996) ; Kato et al., Journal of Biochemistr y 119: 229-236 (1.995) ; Ulich et al., Blood 86: 971-976 (1.995) ]. El MGDF podría ser utilizado para potenciar el proceso de donación de plaquetas, ya que la administración de MGDF aumenta aproximadamente por tres las cuentas de plaquetas circulantes con respecto al valor original en los donantes de plaquetas sanos.

La TPO y el MGDF ejercen su acción por medio de la unión al receptor c-Mpl, que se expresa principalmente en la superficie de ciertas células hematopoyéticas, tales como megacariocitos, plaquetas, células CD34+ y células progenitoras primitivas [N. Debili et al., Blood 85: 391-401 (1.995) ; F. J. de Sauvage et al., Nature 369: 533-538 (1.994) ; T. D. Bartley et al., Cell 77: 1.117-1.124 (1.994) ; S. Lok et al., Nature 369: 565-8 (1.994) ]. Como la mayoría de los receptores para interleucinas y hormonas proteicas, c-Mpl pertenece a la superfamilia de receptores citocínicos de clase I [I. Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5.640-5.644 (1.992) ]. La activación de esta clase de receptores implica la homodimerización de receptores inducida por la unión del ligando, la cual, a su vez, desencadena la cascada de procesos de transducción de señales.

En general, la interacción de un ligando proteico con su receptor tiene a menudo lugar en una interfase relativamente grande. Sin embargo, como se demostró en el caso de la hormona de crecimiento humana unida a su receptor, sólo unos pocos restos clave de la interfase contribuyen realmente a la mayor parte de la energía de unión

[T. Clackson et al., Science 267: 383-386 (1.995) ]. Esto y el hecho de que la mayor parte del ligando proteico

restante sólo sirve para presentar los epítopos ligantes en la topología correcta hacen posible encontrar ligandos 5 activos de tamaño mucho más pequeño.

En un esfuerzo hacia este fin, ha surgido el sistema de presentación de bancos peptídicos en fagos como una potente técnica para identificar pequeños compuestos peptídicos miméticos de ligandos proteicos grandes [J. K. Scott et al., Science 249: 386 (1.990) ; J. J. Devlin et al., Science 249: 404 (1.990) ]. Usando esta técnica, se descubrieron pequeñas moléculas peptídicas que actúan como agonistas del receptor c-Mpl [S. E. Cwirla et al.,

Science 276: 1.696-1.699 (1.997) ].

En dicho estudio, pequeñas secuencias peptídicas aleatorias presentadas como fusiones con las proteínas de la cubierta de un fago filamentoso eran eluidas por afinidad del dominio extracelular de c-Mpl inmovilizado con anticuerpo, y los fagos retenidos resultaban enriquecidos durante un segundo ciclo de purificación por afinidad. Este proceso de selección de unión y repropagación fue repetido muchas veces para enriquecer la colección de 15 compuestos ligantes más fuertes. Como resultado, se identificaron primero dos familias de péptidos ligantes de c-Mpl, no relacionadas entre sí en cuanto a sus secuencias. Luego se crearon bancos por mutagénesis para optimizar más los mejores compuestos ligantes, lo que finalmente condujo al aislamiento de un péptido muy activo con una IC50 = 2 nM y una EC50 = 400 nM [S. E. Cwirla et al., Science 276: 1.696-1.699 (1.997) ]. Este péptido de 14 restos, designado como un péptido mimético de TPO (TMP; del inglés, TPO mimetic peptide) , no tiene una evidente

homología de secuencia con respecto a TPO ni a MGDF. La estructura de este compuesto TMP es la siguiente:

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala ID. SEC. nº 1

o

IEGPTLRQWLAARA

usando abreviaturas de aminoácidos de una sola letra.

Previamente, en un estudio similar sobre péptidos miméticos de EPO, se descubrió un péptido mimético de EPO (EMP; del inglés, EPO mimetic peptide) usando la misma técnica [N. C. Wrighton et al., Science 273: 458-463 (1.996) ] y se halló que actuaba como un dímero al unirse al receptor de EPO (EPOR) . El complejo (ligando) 2/ (receptor) 2 así formado tenía una simetría C2 de acuerdo con los datos cristalográficos por rayos X [O. Livnah et al., Science 273: 464-471 (1.996) ]. Basándose en... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que se une a un receptor mpl, que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la ID. SEC. nº 34

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la ID. SEC. nº46

3. Un dímero del compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para usar en:

(a) incrementar los megacariocitos o plaquetas en un paciente que lo necesite;

(b) tratar la trombocitopenia en un paciente que lo necesite;

(c) tratar la trombocitopenia idiopática o inmune (TPI) en un paciente que lo necesite; o

(d) tratar el síndrome mielodisplásico en un paciente que lo necesite.

5. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la fabricación de un medicamento para:

(a) incrementar los megacariocitos o plaquetas en un paciente que lo necesite;

(b) tratar la trombocitopenia en un paciente que lo necesite;

(c) tratar la trombocitopenia idiopática o inmune (TPI) en un paciente que lo necesite; o

(d) tratar el síndrome mielodisplásico en un paciente que lo necesite.

6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, o el uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde la concentración es de 1!g/kg a 100mg/kg.

7. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en una mezcla con un vehículo farmaceúticamente aceptable del mismo.

8. Un polinucleótido que codifica el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. Un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 9.

11. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha célula huésped es una E.coli.

12. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicha E.coli es una E.coli GM221 depositada en el ATCC con número de acceso 98957.

13. Un método para producir el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en un medio nutriente adecuado y aislar dicho compuesto de dicha célula o medio nutriente.