Partículas modificadas de vectores víricos.

Procedimiento para la generación de una partícula de un vector adenovírico,

que comprende las etapas:

a) generación de una partícula de un vector adenovírico en líneas celulares de empaquetamiento quecomprenden proteínas de la cápside, comprendiendo dichas proteínas de la cápside un sitio de fijación parala modificación específica de la partícula del vector adenovírico, comprendiendo dicho sitio de fijación almenos un residuo de cisteína que está ubicado en un dominio expuesto al disolvente de dicha proteína de lacápside;

b) lisado de las células de empaquetamiento y la subsiguiente purificación de dichas partículas de vectoresadenovíricos en tampones con un pH desde 5,0 hasta 9,0 y exentos de cationes metálicos divalentes, en elque dicho tampón es

(i) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2, o

(ii) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósferade Ar, He, N2 o CO2;

c) poner en contacto los compañeros de acoplamiento con dichas partículas de vectores adenovíricos yrealizar una reacción de acoplamiento de los compañeros de acoplamiento a los residuos de cisteína a travésde enlaces tioéter, disulfuro o tioéster mediante la adición de reactivos alquilantes que comprenden gruposmaleimida, grupos ditiopiridilo o grupos yodoacetilo en un tampón con un pH desde 5,0 hasta 9,0 y exento decationes metálicos divalentes, en el que dicho tampón es

(i) un tampón que comprende reactivos reductores, o

(ii) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósferade Ar, He, N2 o CO2.

Partículas modificadas de vectores víricos

La presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de partículas de vectores adenovíricos que comprende las etapas enumeradas en la reivindicación 1. Adicionalmente, la invención se refiere a partículas de vectores adenovíricos según se define en la reivindicación 6. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de estas partículas de vectores adenovíricos como un medio terapéutico o diagnóstico.

Las partículas de vectores víricos tales como vectores adenovíricos de transferencia génica se usan in vitro e in vivo con objeto de transferir genes a células vivas con propósitos terapéuticos (terapia génica) , con propósitos de vacunación y para estudios funcionales. Las partículas de vectores adenovíricos pueden producirse con altos títulos, su genoma es altamente estable y tienen la capacidad de transducir células proliferativas en reposo. Se pueden distinguir entre diferentes tipos de partículas de vectores adenovíricos: por ejemplo, están las denominadas partículas de vectores de primera generación (las funciones de E1 están delecionadas) , las partículas de vectores de segunda generación (deleción adicional de las funciones de E2 y/o E4) , partículas de vectores de alta capacidad (deleción de la mayoría o de todos los genes víricos) . Además, también hay partículas de vectores adenovíricos de replicación competente (habitualmente denominados adenovirus oncolíticos) , que se usan por ejemplo en la terapia tumoral. Adicionalmente también hay partículas de vectores de adenovirus quiméricos, en los que se han combinado las cápsides de diferentes serotipos. Un ejemplo es la sustitución de la proteína de fibra 5 del serotipo natural por una proteína de fibra derivada de un serotipo diferente, tal como por ejemplo, el serotipo 17 o el serotipo 9.

Se han encontrado adenovirus en numerosas especies. Se conocen más de 50 serotipos humanos diferentes, por ejemplo, Ad12 (Subgénero A) , Ad3 y Ad7 (Subgénero B) , Ad2 y Ad5 (Subgénero C) , Ad8 (Subgénero D) , Ad4 (Subgénero E) , Ad40 (Subgénero F) (Wigand, 1986) . Aparte de detectarse en seres humanos, también se han encontrado adenovirus en la mayoría de los vertebrados incluyendo chimpancés, ganado, cerdos, ratones y pollos. La mayoría de las partículas de vectores usadas actualmente para la transferencia génica se basan en adenovirus del tipo 5 (Ad5) , aunque numerosos laboratorios también están trabajando en el desarrollo de partículas de vectores que o bien se basan en un serotipo diferente de un patógeno humano o bien son aisladas a partir de chimpancés, ganado u otras especies.

La transducción de las células por parte de las partículas de vectores de Ad5 tiene lugar a través de al menos dos receptores. Inicialmente, las partículas del vector se unen al dominio Knob de la proteína de fibra de la cápside del receptor de Coxsackie y de Adenovirus (CAR) . Esta interacción induce modificaciones estructurales menores en la partícula del vector que permiten una interacción entre la proteína de la base pentona de las partículas del vector con las integrinas de la superficie celular. Finalmente, hay una captación mediada por integrina de las partículas del vector en la célula a través de una endocitosis mediada por receptor. Durante la captación de las partículas del vector, en el endosoma temprano tiene lugar un desensamblaje regulado y gradual de las partículas del vector mediante una participación sustancial de la proteasa de cisteína vírica p23, y que se completa después de abandonar el endosoma temprano y durante la entrada al núcleo. Este proceso depende del estado redox de la proteasa de cisteína p23. De este modo el ADN es transportado a los poros nucleares, siendo liberado de los remanentes de cápsides y finalmente translocado al núcleo en la última etapa del proceso de transducción.

Una de las limitaciones de las partículas de vectores adenovíricos para la transferencia génica es que muchos tejidos que representan un posible objetivo para la transferencia génica terapéutica con partículas de vectores adenovíricos no expresan el receptor CAR ni/o las integrinas necesarias. Las partículas de vectores adenovíricos transducen mal dichos tejidos incluso cuando se aplican a dosis altas. Por lo tanto, no es posible la transferencia génica terapéutica. Como ejemplos, pueden mencionarse aquí las células del sistema hematopoyético, la mayoría de los tipos de células tumorales, células neuronales, células musculares y células endoteliales. Además, el uso de vectores adenovíricos derivados de adenovirus aislados a partir de especies distintas a la que se va a tratar con el vector podría verse dificultada debido a las bajas eficacias de transducción.

Una limitación adicional de las partículas de vectores adenovíricos para la transferencia génica se hace apreciable después de la administración sistémica de las partículas del vector en el torrente sanguíneo. Por un lado hay interacciones con componentes sanguíneos celulares y no celulares tales como eritrocitos, plaquetas, el complemento o anticuerpos que son capaces de neutralizar las partículas víricas o que son responsables de reacciones tóxicas, y por otro lado también hay una captación mediada por CAR-/integrinas en los tejidos que no son el objetivo pretendido de aplicación de la partícula del vector. Igualmente limitantes son las interacciones de las partículas del vector con los componentes celulares del sistema inmunitario tales como las células de Kupffer, que pueden dar lugar a una neutralización de las partículas del vector y pueden inducir efectos secundarios indeseables.

El estándar de conocimiento actual incluye dos estrategias diferentes mediante las cuales se puede intentar modificar el tropismo de las partículas del vector vírico o se pueden evitar las interacciones indeseables de las partículas del vector vírico con, por ejemplo, anticuerpos.

La primera estrategia, denominada subsiguientemente como "estrategia genética", consiste en una modificación genética definida de las áreas expuestas al disolvente de varias proteínas de la cápside (por ejemplo, fibra, proteína IX, Hexona) . Aquí se intenta mejorar la transferencia génica en las células objetivo mediante la inserción genética de ligandos peptídicos en, por ejemplo, el dominio Knob de la proteína de fibra del Ad5 (Dmitriev, 1998) . Esta estrategia genética presenta muchos inconvenientes concretos: (i) existe una significativa limitación con respecto al tamaño de los ligandos que se van a usar, ya que los ligandos grandes interfieren con el correcto plegamiento de las proteínas de la cápside modificadas. (ii) No es posible predecir si es posible la producción de las partículas del vector incluso después de la inserción genética de ligandos pequeños, debido a que el correcto plegamiento proteico puede verse alterado. Además, la estructura y la función biológica de los ligandos peptídicos en el contexto de las proteínas de la cápside del vector no son predecibles, y los ligandos peptídicos pequeños habitualmente sólo muestran una afinidad limitada por el receptor objetivo sobre la superficie de las células objetivo. (iii) Las sustanciales modificaciones genéticas, necesarias para una modificación exitosa del tropismo de las partículas del vector adenovíricos, dan lugar a un menor rendimiento en la producción de la partícula del vector. (iv) Para la producción de partículas de vectores modificadas genéticamente con un nuevo tropismo, especialmente cuando las mutaciones adicionales eliminan la interacción con el CAR, es necesario generar una nueva producción de línea celular para cada ligando. Esto es un obstáculo considerable e inhibe el eficiente cribado de los ligandos potenciales. (v) Todos los procedimientos genéticos están limitados por naturaleza a ligandos proteicos/peptídicos para la modificación del tropismo. Los péptidos que contienen aminoácidos no naturales no pueden aplicarse. Además, no pueden aplicarse otras sustancias distintas a las proteínas, por ejemplo, esteroides, otros compuestos aromáticos o carbohidratos y otros.

Una segunda estrategia, denominada subsiguientemente como "estrategia química", consiste en modificaciones químicas inespecíficas de todas las proteínas de la cápside expuestas al disolvente de la partícula del vector. Aquí se usan reacciones químicas con objeto de acoplar ligandos a grupos amino primarios naturales de la superficie de las partículas del vector. Este procedimiento modifica inespecíficamente todas las proteínas de la cápside y se lleva a cabo... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la generación de una partícula de un vector adenovírico, que comprende las etapas:

a) generación de una partícula de un vector adenovírico en líneas celulares de empaquetamiento que comprenden proteínas de la cápside, comprendiendo dichas proteínas de la cápside un sitio de fijación para la modificación específica de la partícula del vector adenovírico, comprendiendo dicho sitio de fijación al menos un residuo de cisteína que está ubicado en un dominio expuesto al disolvente de dicha proteína de la cápside; b) lisado de las células de empaquetamiento y la subsiguiente purificación de dichas partículas de vectores adenovíricos en tampones con un pH desde 5, 0 hasta 9, 0 y exentos de cationes metálicos divalentes, en el que dicho tampón es

(i) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2, o

(ii) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2;

c) poner en contacto los compañeros de acoplamiento con dichas partículas de vectores adenovíricos y realizar una reacción de acoplamiento de los compañeros de acoplamiento a los residuos de cisteína a través de enlaces tioéter, disulfuro o tioéster mediante la adición de reactivos alquilantes que comprenden grupos maleimida, grupos ditiopiridilo o grupos yodoacetilo en un tampón con un pH desde 5, 0 hasta 9, 0 y exento de cationes metálicos divalentes, en el que dicho tampón es

(i) un tampón que comprende reactivos reductores, o

(ii) un tampón con poco oxígeno o sin oxígeno complementado con reactivos reductores en una atmósfera de Ar, He, N2 o CO2.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tampón de la etapa b) y/o de la etapa c) tiene un pH desde 6, 8 hasta 7, 4.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tampón de la etapa b) y/o de la etapa c) tiene un pH de 7, 3.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los cationes metálicos divalentes son Mg2+ oMn2+.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente después de la etapa b) o al mismo tiempo que o después de la etapa c) modificaciones químicas adicionales de las proteínas de la cápside que no implican residuos de cisteína como compañeros de reacción

6. Partícula de vector adenovírico que comprende proteínas de la cápside, en la que dichas proteínas de la cápside comprenden al menos un residuo de cisteína como sitio de fijación, que está unido a través de un enlace de disulfuro, tioéter o tioéster a un compañero de acoplamiento y puede obtenerse mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 6, en el que las proteínas de la cápside están modificadas químicamente mediante reacciones químicas que no implican grupos tiol como compañeros de reacción para la reacción de modificación.

8. Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 6 ó 7, que comprende al menos dos compañeros de acoplamiento diferentes.

9. Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la cual un compañero de acoplamiento tiene uno o más sitios de fijación.

10. Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la cual dicho (s) compañero (s) de acoplamiento es/son ligandos específicos celulares, polímeros, especialmente derivados de PEG o derivados de HPMA, partículas de nanooro, pigmentos fluorescentes, sustancias magnéticas o sustancias bioquímicamente/catalíticamente activas.

11. Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la cual dicho sitio de fijación tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más residuos de cisteína, y en la cual dos o más de dichos residuos de cisteína son consecutivos o están separados por 1, 2, 3 o más residuos de aminoácidos que son diferentes de la cisteína.

12. Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 11, comprendiendo dicho sitio de fijación los aminoácidos según la ID. SEC. Nº: 1, la ID. SEC. Nº: 2 o la ID. SEC. Nº: 3.

13. Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en la cual las proteínas de la cápside del adenovirus se eligen de entre proteína de fibra, Hexona, base Pentona y proteína IX.

14. Partícula de vector adenovírico según la reivindicación 13, comprendiendo dicha proteína de fibra los aminoácidos según la ID. SEC. Nº: 13, la ID. SEC. Nº: 14 o la ID. SEC. Nº: 15.

15. Uso de dicha partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 como medio diagnóstico en vertebrados, en particular, en seres humanos y primates.

16. Partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 para su uso como medio terapéutico o profiláctico en vertebrados, en particular, en seres humanos y primates.

17. Uso de dicha partícula de vector adenovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 in vitro como un medio terapéutico, profiláctico o diagnóstico en cultivos tisulares o celulares que comprenden células de vertebrados, en particular, de seres humanos y primates.