Nuevo biomarcador, ITIH4, para la detección de la predisposición a una patología mamaria no tumoral.

La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para la detección de una predisposición a una patología mamaria no tumoral que comprende la detección y/o cuantificación de la proteína biomarcadora ITIH4, de cualquiera de los ácidos nucléicos que codifican para dicha proteína o de cualquiera de sus fragmentos, presentes en una muestra de leche obtenida de un mamífero. Los datos obtenidos se pueden comparar con datos estándar para encontrar alguna desviación significativa y atribuir la desviación a dicha predisposición del mamífero a padecer una patología mamaria no tumoral. La patología mamaria no tumoral es preferiblemente mastitis

Nuevo biomarcador, ITIH4, para la detección de la predisposición a una patología mamaria no tumoral.

La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para la detección de una predisposición a una patología mamaria no tumoral que comprende la detección y/o cuantificación de la proteína biomarcadora ITIH4, de cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para dicha proteína o de cualquiera de sus fragmentos, presentes en una muestra de leche obtenida de un mamífero. Los datos obtenidos se pueden comparar con datos estándar para encontrar alguna desviación significativa y atribuir la desviación a dicha predisposición del mamífero a padecer una patología mamaria no tumoral. La patología mamaria no tumoral es preferiblemente mastitis.

Estado de la técnica anterior La respuesta de fase aguda es una reacción compleja de los animales superiores frente al estrés, infecciones, daño tisular, cáncer o alteraciones inmunológicas. Los tejidos afectados y el sistema vascular circundante inducen la acción de las plaquetas, la formación de coágulos y la activación de células inflamatorias. Como consecuencia de ese proceso se induce la síntesis de hormonas y citoquinas, las cuales desencadenan una reacción sistémica que termina con la muerte celular de las células afectadas. Además, entre otros numerosos efectos observados, se producen cambios significativos en la concentración de algunas proteínas que de manera genérica se denominan “proteínas de fase aguda” (PFA) (Baumann y Gauldie, 1994. Immunol Today 15 (2) : 74-80) .

Las PFA se han estudiado ampliamente en humanos, por razones obvias de interés clínico, y en muchas especies animales. En vacuno, varias PFA entre ellas el amiloide sérico, la haptoglobina, la alfa-1-glicoproteína y la alfa-1antitripsina aumentan su concentración sérica en diferentes procesos inflamatorios (Eckersall y Conner, 1988. Vet Res Commun 12 (2-3) : 169-78; Heegaard et al., 2000. Vet Immunol Immunopathol 77 (1-2) : 151-159; Hirvonen et al, 1996. J Dair y Res 63 (3) : 351-60) .

La proteína ITIH4, inicialmente denominada pig-MAP (del inglés, pig Major Acute-phase Protein) (González-Ramón et al., 1995. FEBS Lett 371 (3) : 227-30) , se ha estudiado recientemente en diferentes especies animales y fundamentalmente en el caso porcino, bovino y humano. En este sentido, la determinación inmunoquímica de su concentración en el suero sanguíneo de animales durante infecciones experimentales bacteriana y vírica, ha indicado que ITIH4 es una nueva proteína de fase aguda en la vaca (Piñeiro et al., 2004. Infection and immunity. 72 (7) : 37773782) .

La familia del inhibidor de tripsina inter-α (ITI) comprende una serie de proteínas plasmáticas que se ensamblan a partir de dos proteínas precursoras: una cadena ligera (bikunina) y diferentes cadenas pesadas. La familia de las cadenas pesadas (ITIHs) consta de 5 miembros, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4 y la recientemente caracterizada ITIH5. En la especie bovina, ITIH1, ITIH3 e ITIH4 están localizadas en el cromosoma 22, mientras que ITIH2 e ITIH5 se localizan en el cromosoma 13. En la especie humana ITIH1, ITIH3 e ITIH4 también se localizan en un mismo cromosoma diferente al de ITIH2 e ITIH5. El polipéptido bikunina se une a las cadenas pesadas H1, H2, H3 y H5, pero no a la H4.

Los miembros de la familia ITI están regulados de diferente manera durante la fase aguda: la expresión de la cadena H2 y la bikunina se ve disminuida, mientras que la cadena H3 se sobre-expresa durante la fase aguda en pacientes con inflamación aguda y en células humanas HepB3 de hepatocarcinoma después del tratamiento con IL

6. Se ha observado además, en células HepG2 estimuladas con IL-6 un aumento en la expresión del mRNA de las cadenas H1 y H3, al mismo tiempo que una disminución del mensajero de H2. Hechos similares, es decir, sobreexpresión del mRNA de H3 y disminución del mRNA hepático de H2 y la bikunina se han observado en ratas durante una inflamación inducida por trementina. Los niveles de expresión del mRNA de H4 humano y de cerdo y la secreción de proteína están fuertemente estimulados por IL-6 en células de hepatoma HepG2 y en hepatocitos de cerdo aislados.

La presencia de la proteína ITIH4 está asociada a procesos patológicos, especialmente los que cursan con inflamación de la glándula mamaria. Sin embargo, la concentración de la proteína varía durante el proceso patológico pudiendo presentarse un nivel muy bajo y prácticamente indetectable. Los animales de producciones intensivas ganaderas sufren un gran número de patologías producidas fundamentalmente por infecciones de diversa etiología que producen pérdidas en la producción y en la calidad de la leche. Actualmente, los métodos de detección de estas patologías son caros y largos, ya que se necesitan varios días para conocer el resultado (cultivo bacteriano y detección del patógeno) ó bien no son totalmente fiables (p. ej: contaje de las células somáticas) .

Por todo ello sería muy ventajoso para la salud del animal afectado, poder disponer de un método de detección de la predisposición de un animal a desarrollar una patología mamaria no tumoral mediante un método que proporcione una detección fiable, lo más tempranamente posible y que prescinda de técnicas invasivas y/o agresivas para el animal objeto de estudio.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para la detección de una predisposición a una patología mamaria no tumoral que comprende la detección y/o cuantificación de la proteína biomarcadora ITIH4, de cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para dicha proteína o de cualquiera de sus fragmentos, presentes en una muestra de leche obtenida de un animal mamífero. Los datos obtenidos se pueden comparar con datos estándar para encontrar alguna desviación significativa y también puede atribuirse la desviación a dicha predisposición del mamífero a padecer una patología mamaria no tumoral donde la patología mamaria no tumoral es preferiblemente mastitis. Una de las ventajas fundamentales de la presente invención es que la proteína biomarcadora puede ser detectada varias horas antes en la muestra de leche que en el suero sanguíneo, lo que implica una ventaja notable para los mamíferos afectados. Este método evita cualquier tipo de estrés al animal ya que comprende una técnica que no es invasiva ni agresiva.

La presencia de la proteína ITIH4 está asociada a procesos patológicos, especialmente los que cursan con infección o inflamación de la mama y su presencia puede ser detectada en la leche varias horas antes que en el suero sanguíneo, lo que implica una ventaja notable ya que el tratamiento para la patología mamaria no tumoral que podría desarrollar el mamífero, se lleva a cabo con mayor antelación que en el caso de la detección de la predisposición por cualquier otro medio o incluso de la detección de la propia patología.

La detección y/o cuantificación de la proteína en leche tiene interés, sobre todo, en la clínica veterinaria para la determinación temprana de patologías mamarias no tumorales.

Los animales de producciones intensivas ganaderas sufren un gran número de patologías no tumorales producidas fundamentalmente por infecciones de diversa etiología que cursan mayoritariamente con inflamación de la glándula mamaria y producen pérdidas significativas en la producción y en la calidad de la leche. La patología mamaria más importante en el ganado bovino es la mastitis. Esta enfermedad posee dos estadios: mastitis subclínica y mastitis clínica. Las dificultades encontradas en el diagnóstico y detección de la patología subclínica, donde la mama y la leche presentan un aspecto normal, son sin lugar a dudas una de las principales causas del elevado coste que supone.

El problema que se resuelve con la presente invención es identificar de una manera rápida a los animales enfermos para que puedan ser tratados de forma temprana y evitar el contagio en un mismo rebaño. Por tanto, podemos citar las siguientes ventajas:

Ventaja 1:

- El análisis bacteriológico de la leche, es un método caro y se necesitan varios días para conocer el resultado. Con esta nueva invención, el resultado es mucho más rápido y económico.

- El contaje de células somáticas de la leche, exigido por la normativa europea, sufre variaciones dependientes de diversos factores como los días de ordeño, la edad del animal, la estación del año, el sobreordeño, etc,... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de datos útiles para la detección de una predisposición a una patología mamaria no tumoral que comprende:

a. Obtener una muestra de leche de un mamífero,

b. detectar y/o cuantificar uno o más productos de la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica con al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1, presentes en la muestra de leche según el apartado (a) , o cualquier fragmento de dichos productos.

2. Método según la reivindicación 1 donde la secuencia aminoacídica del apartado (b) es SEQ ID NO: 1.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones1ó2, donde además comprende comparar los datos obtenidos en el apartado (b) con datos estándar para encontrar alguna desviación significativa.

4. Método según la reivindicación 3, donde además se atribuye la desviación significativa a una predisposición de un mamífero a padecer una patología mamaria no tumoral.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a4 donde la patología mamaria no tumoral es mastitis.

6. Método según la reivindicación 5 donde la mastitis es puerperal.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 donde la mastitis se produce por una infección de la mama causada por un agente microbiano.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la muestra de leche se obtiene de un mamífero no humano.

9. Método según la reivindicación 8, donde el mamífero pertenece a la especie Bos taurus.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de la expresión es un ARN mensajero (ARNm) .

11. Método según la reivindicación 10 que comprende:

a. Sintetizar uno o más fragmentos de un ADN codificado (ADNc) por una secuencia de ARNm que codifica para una secuencia aminoacídica con al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1 o que codifica para SEQ ID NO: 1, mediante RT-PCR, y

b. detectar y/o cuantificar el fragmento sintetizado según el apartado (a) .

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde la detección y/o cuantificación del fragmento de ARNm o ADNc se lleva a cabo por medio de técnicas cromatográficas y/o electroforéticas.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de la expresión es una proteína o cualquiera de sus fragmentos.

14. Método según la reivindicación 13 donde la proteína o cualquiera de sus fragmentos se detecta y/o cuantifica por medio de técnicas seleccionadas de la lista que comprende técnicas cromatográficas, electroforéricas o inmunoquímicas, o por cualquiera de sus combinaciones.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde la proteína o cualquiera de sus fragmentos se detecta en un periodo de entre 12 y 30 horas después del comienzo de una infección de la mama por un agente microbiano.

16. Uso de uno o más productos de la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica con al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1 como biomarcador de una patología mamaria no tumoral, obtenido en una muestra de leche.

17. Uso de uno o más productos de la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica con al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1 como biomarcador para la monitorización del tratamiento de una patología mamaria no tumoral, obtenido en una muestra de leche.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 donde la patología mamaria no tumoral es mastitis.

20. Kit para la obtención de datos útiles para la detección de una predisposición a una patología mamaria no tumoral o para la monitorización del tratamiento de dicha patología que comprende una o más sondas:

a. para reconocer uno o más productos de la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica con al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1,

b. para reconocer uno o más productos de la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, o

c. para reconocer cualquier fragmento de dichos productos.

21. Kit según la reivindicación 20, donde las sondas están fijadas a un soporte sólido.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 donde las sondas son anticuerpos.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Zaragoza <120> Nuevo biomarcador, ITIH4, para la detección de la predisposición a una patología mamaria no tumoral <130> ES1510.32

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 914

<212> PRT

<213> Bos taurus <400> 1

ES 2 355 461 A1

ES 2 355 461 A1

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Bos taurus <400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Bos taurus

ES 2 355 461 A1

<400> 3