Nuevas composiciones de laccasas y sus procedimientos de utilización.
Una laccasa aislada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
14 o SEQ ID NO: 16, oque tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % a la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/025533.
Solicitante: DANISCO US INC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 925 PAGE MILL ROAD PALO ALTO, CA 94304 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: WANG,HUAMING, MCAULIFFE,Joseph C.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/53 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
- C12N9/02 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
- D06L3/00
- D06P5/00 TEXTILES; PAPEL. › D06 TRATAMIENTO DE TEXTILES O SIMILARES; LAVANDERIA; MATERIALES FLEXIBLES NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR. › D06P TEÑIDO O IMPRESION DE TEXTILES; TEÑIDO DE CUERO, DE PIELES O DE SUSTANCIAS MACROMOLECULARES SOLIDAS DE CUALQUIER FORMA. › Otras características del teñido o de la impresión de textiles o del teñido del cuero, de pieles o de sustancias macromoleculares de todas formas.
PDF original: ES-2386991_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Nuevas composiciones de laccasas y sus procedimientos de utilización
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está relacionada con las laccasas y con secuencias de ácidos nucleicos que codifican las laccasas, y con procedimientos enzimáticos para el blanqueo de materiales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las laccasas son enzimas que contienen cobre conocidas por ser buenos agentes oxidantes en presencia de oxígeno. Las laccasas se encuentran en microbios, hongos, y organismos superiores. Las enzimas laccasas se utilizan para numerosos aplicaciones, incluyendo el blanqueo de pulpa de celulosa y de materiales textiles, el tratamiento de aguas residuales de la pulpa de celulosa, desteñido, eliminación industrial del color, detergentes blanqueantes de lavandería, blanqueantes dentarios para el cuidado bucal, y como catalizadores o ayudantes para las reacciones de polimerización y oxidación.
Las laccasas se pueden utilizar para una gran variedad de aplicaciones en una serie de industrias, incluyendo la industria de los detergentes, la industria del papel y pulpa de celulosa, la industria textil y la industria alimentaria. En una aplicación, se utilizan enzimas que oxidan el fenol como ayudante para la eliminación de manchas de la ropa, tales como manchas de comida, durante el lavado con detergente.
La mayoría de laccasas presentan un pH óptimo en el intervalo de pH ácido mientras que permanecen inactivas a pH neutros o alcalinos.
Se sabe que las laccasas son producidas por una amplia variedad de hongos, incluyendo las especies del género Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botr y tis, Pleurotus, Fornes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Stachybotr y s, Rhizoctonia, Bipolaris, Curvularia, Amerosporium, y Lentinus.
Zhang y col. (Enz. Microb. Tech. 39 (2006) 92 – 97) describen la caracterización y capacidad de decoloración de una laccasa procedente de Panus rudis.
Michniewicz y col. (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 69: 682-688) describen la caracterización de dos isoformas de una laccasa procedente de la cepa 137 de Cerrena unicolor.
No obstante, aún existe la necesidad de laccasas que tengan diferentes perfiles de comportamiento en diversas aplicaciones.
Para muchas aplicaciones, la eficacia oxidante de una laccasa se puede mejorar con la utilización de un mediador, también conocido como agente potenciador. Los sistemas que incluyen una laccasa y un mediador son conocidos en la materia como sistemas laccasa-mediador (LMS) . Los mismos compuestos también se pueden utilizar para activar o iniciar la acción de la laccasa.
Existen varios mediadores conocidos para su utilización en un sistema laccasa-mediador. Éstos incluyen HBT (1-hidroxibenzotriazol) , ABTS [ácido 2, 2'-azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfínico) ], NHA (N-hidroxiacetanilida) , NEIAA (N-acetil-N-fenilhidroxilamina) , HBTO (3-hidroxi-1, 2, 3-benzotriazin-4 (3H) -ona) , y VIO (ácido violúrico) . Además, se ha encontrado que existen varios compuestos que contienen NH-OH o N-O que son útiles como mediadores.
Los grupos funcionales y los sustituyentes tienen grandes efectos sobre la eficacia del mediador. Incluso dentro de la misma clase de compuestos, un sustituyente puede cambiar la especificidad de la laccasa hacia un sustrato, de esta forma incrementando o reduciendo enormemente la eficacia del mediador. Además, un mediador puede ser eficaz para una aplicación particular, pero no apto para otra aplicación. Otro inconveniente de los mediadores actuales es su tendencia a polimerizar durante su utilización. Así, existe la necesidad de descubrir mediadores eficientes para aplicaciones específicas. Una de dichas aplicaciones es el blanqueo de materiales textiles, en donde también es importante que los mediadores no sean indebidamente costosos o peligrosos. A continuación se proporcionan otras aplicaciones del sistema laccasa-mediador.
Así, existe la necesidad de identificar mediadores adicionales que activen la laccasa, y/o potencien la actividad de enzimas que presenten actividad laccasa.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En el presente documento se describen nuevas laccasas, secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichas laccasas, y vectores y células hospedadoras para la expresión de las laccasas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Trichoderma, pTrex3glaccaseA, utilizado en el Ejemplo 7. El gen A de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
La Figura 2 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Aspergillus, pKB401, utilizado en el Ejemplo 8a. El gen B de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
La Figura 3 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Aspergillus, pKB403, utilizado en el Ejemplo 8b. El gen B de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Trichoderma, pTrex4laccaseB, utilizado en el Ejemplo 8d. El gen B de la laccasa está fusionado al gen que codifica el dominio catalítico de CBH1. El gen B de la laccasa se puede sustituir con otros genes de la laccasa descritos en el presente documento.
La Figura 5 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Streptomyces (pKB251) para el gen B de la laccasa optimizado codónicamente, utilizado en el Ejemplo 9.
La Figura 6 es una representación esquemática del plásmido de expresión de Bacillus (p2JMagk1031nk2Elaccase) para el gen D de la laccasa optimizado codónicamente fusionado al gen que codifica BCE103, utilizado en el Ejemplo 13.
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra los resultados del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de la especie Thielavia y una variedad de mediadores a unas concentraciones de 50 y 500 µM.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra los resultados del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de las especies Thielavia, Myceliophthora y Cerrena y una variedad de mediadores a pH 5.
La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra los resultados del blanqueo de índigo soluble utilizando una laccasa de las especies Thielavia, Myceliophthora y Cerrena y una variedad de mediadores a pH 7.
La Figura 10 es una gráfica con la diferencia total de color para la laccasa D recombinante y el mediador siringamida en función de la concentración de mediador y la concentración de enzima a 60 °C y pH 6.
La Figura 11 es una gráfica con la diferencia total de color para la laccasa D recombinante y el mediador siringonitrilo en función de la concentración de mediador y la concentración de enzima a 60 °C y pH 6.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A menos que se defina otra cosa en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen los mismos significados entendidos habitualmente por alguien con conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton, y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) , y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a alguien con conocimientos un diccionario general con muchos de los términos utilizados en esta invención. A pesar de que se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o puesta a prueba de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Se debe entender que esta invención no está limitada por la metodología, protocolos, y reactivos particulares descritos, puesto que pueden cambiar.
1. Laccasa y enzimas relacionadas con las laccasas
En el contexto de esta invención, las laccasas se encuentran en la clasificación de enzimas (EC 1.10.3.2) . Se conocen enzimas laccasas de origen microbiano y vegetal.
La invención proporciona una laccasa que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Una laccasa aislada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16, o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % a la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.
2. Un ácido nucleico aislado que codifica una laccasa según la reivindicación 1.
3. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2 en el que dicho ácido nucleico tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.
4. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 2 o la reivindicación
3.
5. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión según la reivindicación 4.
6. Un procedimiento de blanqueo de colorantes en una disolución, procedimiento que comprende el tratamiento de los colorantes en la disolución con una laccasa de la reivindicación 1 y un mediador eficaz.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el mediador se selecciona del grupo constituido por acetosiringona, siringaldehído, siringamida, metilsiringamida, 2-hidroxietil siringamida, siringato de metilo, siringonitrilo, dimetilsiringamida, y ácido siríngico.
8. El uso de una laccasa según la reivindicación 1 en un procedimiento para el blanqueo de tejidos.
9. El uso según la reivindicación 8 en el que el procedimiento comprende además la utilización de un mediador seleccionado del grupo constituido por acetosiringona, siringaldehído, siringamida, metilsiringamida, 2hidroxietil siringamida, siringato de metilo, siringonitrilo, dimetilsiringamida, y ácido siríngico.
10. Un procedimiento según la reivindicación 8, en donde el tejido se tiñe con un colorante de tina.
11. Un procedimiento según la reivindicación 8, en donde el tejido es un tejido celulósico, una mezcla de fibras celulósicas, o una mezcla de fibras celulósicas y sintéticas.
12. Un procedimiento según la reivindicación 8, en donde el tejido es tejido vaquero.
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