Nueva sonda de detección.

Sonda de detección de un ácido nucleico diana, constituida por una cadena nucleotídica marcada que comprende tres fragmentos:

- un primer fragmento que presenta una primera secuencia de cierre,

- un segundo fragmento del que todo o parte presenta una secuencia de reconocimiento para el reconocimiento molecular del ácido nucleico diana,

- un tercer fragmento que presenta una segunda secuencia de cierre, y

- al menos dos marcadores, estando uno de los extremos de la cadena de dicha sonda de detección libre de cualquier marcador, en la que, cuando las dos secuencias de cierre hibridan juntas, la sonda de detección tiene una forma completamente circular, manteniendo de este modo dichas secuencias de cierre a dicha sonda en una conformación no detectable en ausencia de dicho ácido nucleico.

Nueva sonda de detección.

La presente invención se refiere a la detección de ácidos nucleicos mediante nuevas sondas nucleotídicas. La invención es aplicable en el campo del diagnóstico.

Hoy en día, la búsqueda de secuencias nucleotídicas diana representa un objetivo fundamental en numerosos laboratorios y principalmente en el campo médico o agroalimentario. En estos campos, la búsqueda de secuencias diana tiene como objetivo, por ejemplo, la detección de organismos patógenos, la búsqueda de una contaminación bacteriana en una cadena agroalimentaria o también el diagnóstico de mutaciones en el origen de enfermedades genéticas o de cánceres. Las principales dificultades de estos métodos residen en la especificidad, la sensibilidad, la rapidez y la reproductibilidad del ensayo utilizado. Es indispensable poder dar un resultado cierto y esto esencialmente en el campo del diagnóstico.

En la bibliografía se describen diferentes tipos de métodos. Estos se basan generalmente en las propiedades de apareamiento de las cadenas complementarias de ácidos nucleicos, denominada habitualmente "hibridación de ácidos nucleicos" o simplemente "hibridación". Véase D. ZHANG et al., Clinica chimica acta 363 (2006) págs. 61-70, o J. Yi, Nucleic acid research (2006) Vol 34 (11) , l81. De manera general, después de determinar la secuencia específica de un organismo o de una enfermedad que debe analizarse, es conveniente extraer los ácidos nucleicos de una muestra, y eventualmente amplificar y detectar la secuencia de interés. De este modo, se han desarrollado numerosos métodos de amplificación tales como PCR, LCR, NASBA, TMA, SDA. Del mismo modo, existe un gran número de técnicas de detección. Una de ellas emplea sondas particulares, descritas por Tyagi & Kramer (Nature Biotech, 1996, 14: 303-308) , conocidas habitualmente con el nombre de "molecular beacons" (balizas moleculares) . Estas sondas tienen una estructura en horquilla para el pelo que comprende una parte de "bucle" de cadena sencilla y una parte de "tallo" de cadena doble. La parte de "bucle" contiene una secuencia complementaria de la secuencia nucleotídica diana y la parte de "tallo" está formada por dos secuencias complementarias una de la otra. El extremo libre de una de las secuencias complementarias de la parte de "tallo" está marcado con un fluoróforo mientras que el otro extremo libre de la otra cadena de la parte de "tallo" está acoplado a un extintor de fluorescencia o "quencher". En ausencia de una secuencia diana complementaria, la sonda de detección está en forma de horquilla para el pelo y la sonda no produce fluorescencia, siendo la energía del fluoróforo transferida directamente al extintor de fluorescencia. Cuando esta sonda hibrida con una secuencia diana, pierde su configuración, los extremos 5' y 3' se alejan y el extintor de fluorescencia y el fluoróforo se separan uno del otro. La fluorescencia emitida refleja entonces la hibridación de la sonda en la diana que es detectada durante su amplificación y eventualmente cuantificada. Se habla entonces de la detección en fase homogénea en tiempo real (o detección en "real-time") . Sin embargo, estas sondas molecular beacon pueden presentar una apertura prematura no deseada de la parte de "tallo" en presencia de ciertos contaminantes. En efecto, se ha observado que las sondas molecular beacons interactúan, mediante mecanismos desconocidos, con las enzimas presentes en el medio de reacción tal como el utilizado en una amplificación de tipo NASBA, por ejemplo. Estas interacciones se producen en ausencia, incluso, de cualquier diana biológica y están en el origen de un aumento de señal de fluorescencia no específica.

Las sondas molecular beacons presentan importantes limitaciones de síntesis, requieren un diseño muy particular a nivel de las secuencias del tallo. En efecto, pueden hibridar de forma no específica con la diana a detectar, particularmente cuando ésta es rica en bases GC, induciendo falsos positivos o ruidos de fondo importantes que afectan a la sensibilidad de detección. Además, es necesario introducir dos secuencias complementarias para formar el tallo, la secuencia completa de la sonda en horquilla para el pelo comprende entonces al menos 30 nucleótidos, mientras que solamente 20 nucleótidos son generalmente necesarios para el reconocimiento molecular. Debido a esto, el rendimiento de síntesis de estas sondas en horquilla para el pelo es bastante limitado. Otro inconveniente de estas sondas es la dificultad de diseño de la estructura en horquilla para el pelo debido a la estructura "tallo-bucle" que facilita el repliegue del bucle sobre sí mismo y las interacciones internas "bucle-bucle". De este modo, varios diseños y síntesis son entonces a menudo necesarios antes de encontrar la secuencia que posee las características termodinámicas buscadas.

Se han propuesto diferentes soluciones para intentar paliar el problema de hibridación no específica del tallo. De este modo, Crey-Desbiolles et al. (Nucleic Acids Res., mayo de 2005; 33: e77) propusieron la sustitución de los nucleótidos naturales del tallo por nucleótidos modificados que hibridan entre sí para formar el tallo pero que no pueden hibridar con los nucleótidos naturales de la diana. El inconveniente de esta estrategia es, principalmente, la necesidad de introducir, en cada extremo de la secuencia de reconocimiento, al menos de cuatro a cinco unidades de este nucleótido modificado, mientras que no está disponible en el mercado, lo que complica la síntesis de la sonda en horquilla para el pelo. Por otro lado, esta estrategia no resuelve el problema del elevado número de nucleótidos de la secuencia completa ni el de la dificultad de diseño de la estructura de la horquilla para el pelo.

Otra solución propuesta por Browne (J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 1989-1994) consiste en introducir nucleótidos invertidos en las dos secuencias del tallo. En esta realización, las secuencias del tallo no pueden hibridar directamente con las secuencias de la diana contiguas a la secuencia hibridada con el bucle, debido a su orientación paralela con la diana. El inconveniente de esta técnica es que las secuencias del tallo pueden interactuar con otras secuencias de la diana más lejanas que podrían replegarse y hacerse accesibles para esta interacción. Además, los problemas del elevado número de nucleótidos de la secuencia completa y el de la inestabilidad de la estructura en horquilla para el pelo no se resuelven mediante esta estrategia.

Otra solución propuesta por Tsourkas et al. (Nucleic Acids Res., octubre de 2002; 30: 4208 -4215) consiste en diseñar la sonda en horquilla para el pelo de tal manera que una de las secuencias que forman el tallo forme también parte de la secuencia de reconocimiento. Esta solución permite acortar la secuencia completa de la sonda. Sin embargo, se ha observado una pérdida de especificidad, asociada a este diseño. Además, para la misma secuencia de reconocimiento, este tipo de diseño posee un bucle más corto, lo que limita su flexibilidad y refuerza las interacciones bucle-bucle, lo que hace a las características termodinámicas de la sonda menos previsibles.

Existe, por lo tanto, una necesidad real de un nuevo formato de sonda que permita paliar los inconvenientes de la técnica anterior.

A este respecto, la invención se refiere a una nueva sonda de detección de un ácido nucleico diana, constituida por una cadena nucleotídica marcada que comprende tres fragmentos:

- un primer fragmento que presenta una primera secuencia de cierre,

- un segundo fragmento del que todo o parte presenta una secuencia de reconocimiento para el reconocimiento molecular del ácido nucleico diana,

- un tercer fragmento que presenta una segunda secuencia de cierre, y

- al menos dos marcadores, estando uno de los extremos de la cadena de dicha sonda de detección libre de cualquier marcador,

en la que, cuando las dos secuencias de cierre hibridan conjuntamente, la sonda de detección tiene una forma completamente circular, manteniendo dichas secuencias de cierre de este modo a dicha sonda en una conformación no detectable en ausencia de dicho ácido nucleico diana. Se entiende por completamente circular, una conformación de la sonda cuando las dos secuencias de cierre hibridan una con la otra para formar una doble hélice, estando uno de los extremos de una de las secuencias de cierre unido al extremo opuesto de la otra secuencia de cierre por medio de la secuencia de reconocimiento, formando el conjunto un círculo de acuerdo con las figuras 1 y 2. Al contrario que una estructura en horquilla para el pelo, esta conformación permite... [Seguir leyendo]

1. Sonda de detección de un ácido nucleico diana, constituida por una cadena nucleotídica marcada que comprende tres fragmentos:

- un primer fragmento que presenta una primera secuencia de cierre,

- un segundo fragmento del que todo o parte presenta una secuencia de reconocimiento para el reconocimiento molecular del ácido nucleico diana,

- un tercer fragmento que presenta una segunda secuencia de cierre, y

- al menos dos marcadores, estando uno de los extremos de la cadena de dicha sonda de detección libre de cualquier marcador,

en la que, cuando las dos secuencias de cierre hibridan juntas, la sonda de detección tiene una forma completamente circular, manteniendo de este modo dichas secuencias de cierre a dicha sonda en una conformación no detectable en ausencia de dicho ácido nucleico.

2. Sonda de detección de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque un primer marcador es portado por un nucleótido del primer fragmento y un segundo marcador es portado por un nucleótido del segundo o del tercer fragmento, siendo los dos nucleótidos contiguos cuando las dos secuencias de cierre están hibridadas.

3. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque todo

o parte de las dos secuencias de cierre hibridan de forma paralela.

4. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque toda o parte de una de las secuencias de cierre es una secuencia constituida por nucleótidos alfa.

5. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque todo o parte de las dos secuencias de cierre hibridan de forma antiparalela.

6. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 5, caracterizada porque una de las dos secuencias de cierre está unida a la secuencia de reconocimiento mediante un enlace invertid.

5. 5' o3'-3'.

7. Sonda de detección, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque al menos un marcador es un fluoróforo y al menos otro marcador es un extintor de fluorescencia.

8. Sonda, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque toda o parte de la primera o de la segunda secuencia de cierre puede hibridar con la secuencia diana.

9. Sonda, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque una secuencia nucleotídica está unida al extremo de una de las secuencias de cierre.

10. Método para detectar una secuencia diana susceptible de estar presente en una muestra que comprende las siguientes etapas:

- poner en contacto a la muestra con una sonda de detección de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

- detectar la formación de un híbrido entre la sonda de detección y la secuencia diana, lo que indica la presencia de dicha secuencia diana en dicha muestra.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la detección se realiza conjuntamente con una reacción de amplificación de la secuencia diana.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la detección se realiza después de una reacción de amplificación de la secuencia diana.

13. Kit para detectar una secuencia diana que comprende al menos una sonda de detección de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.