Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica una proteasa NS3/4Ade HCV,

o su fragmento biológicamente activo o su análogo biológicamente activo, en el que el codón quecorresponde al codón 156 de un polinucleótido de NS3/4A de HCV de tipo salvaje está mutado de modo que codificauna serina

Mutantes de resistencia de la proteasa NS3/4A de HCV.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a mutantes de resistencia de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C.

Antecedentes de la técnica relacionada

La infección por el virus de la hepatitis C (“HCV”) es un problema médico humano apremiante. Se reconoce al HCV como el agente causativo de la mayoría de los casos de hepatitis no-A, no-B, con una seroprevalencia en humanos calculada del 3% a nivel global [A. Alberti et al., “Natural Histor y of Hepatitis C”, J. Hepatology, 31 (supl. 1) , pp. 17-24 (1999) ]. Casi cuatro millones de individuos pueden estar infectados sólo en EEUU [M.J. Alter et al., “The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437-455 (1994) ; M.J. Alter, “Hepatitis C Virus Infection in the United States”, J. Hepatology, 31 (supl. 1) , pp. 88-91 (1999) ].

Tras la primera exposición al HCV sólo aproximadamente 20% de los individuos infectados desarrollan una hepatitis clínica aguda, mientras que otros no desarrollan síntomas externos significativos de la infección. Sin embargo, en casi 70% de los casos, el virus establece una infección crónica que persiste durante décadas [S. Iwarson, “The Natural Course of Chronic Hepatitis”, FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 201-204 (1994) ; D. Lavanchy, “Global Surveillance and Control of Hepatitis C”, J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999) ]. Esto habitualmente produce una inflamación hepática recurrente y progresivamente agravante que a menudo conduce a estados de la enfermedad más graves, tales como cirrosis y carcinoma hepatocelular [M.C. Kew, “Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma”, FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220 (1994) ; I. Saito et al., “Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 6547-6549 (1990) ]. Por desgracia, no existen tratamientos ampliamente eficaces para el avance debilitante del HCV crónico.

El genoma de HCV codifica una poliproteína de 3010-3033 aminoácidos [Q.L. Choo et al., “Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 2451-2455 (1991) ; N. Kato et al., “Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9524-9528 (1990) ; A. Takamizawa et al., “Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers”, J. Virol., 65, pp. 1105-1113 (1991) ]. Se cree que las proteínas no estructurales (NS) del HCV proporcionan la maquinaria catalítica esencial para la replicación vírica. Las proteínas NS surgen por la ruptura proteolítica de la poliproteína [R. Bartenschlager et al., “Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions”, J. Virol., 67, pp. 3835-3844 (1993) ; A. Grakoui et al., “Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites”, J. Virol., 67, pp. 2832-2843 (1993) ;

A. Grakoui et al., “Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products”, J. Virol., 67, pp. 1385-1395 (1993) ; L. Tomei et al., “NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein”,

J. Virol., 67, pp. 4017-4026 (1993) ].

La proteína NS 3 (NS3) de HCV contiene actividad serina proteasa que procesa la poliproteína vírica para generar la mayoría de las enzimas víricas, y es fundamental para la replicación y la infectividad vírica. Se ha demostrado que los primeros 181 aminoácidos de NS3 (restos 1027-1207 de la poliproteína vírica) contienen el dominio de serina proteasa de NS3 que procesa los cuatros sitios cadena debajo de la poliproteína de HCV [C. Lin et al., “Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, pp. 8147-8157 (1994) ]. Las sustituciones de la tríada catalítica de la serina proteasa NS3 de HCV producen la pérdida de la replicación y la infectividad víricas en chimpancés [A.A. Kolykhalov et al., “Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3’ nontranslated region are essential for virus replication in vivo”, J. Virol., 74:2046-2051]. Se sabe que las mutaciones en la proteasa NS3 del virus de la fiebre amarilla disminuyen la infectividad vírica [Chambers, T.J., et al., “Evidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 8898-8902 (1990) ].

La serina proteasa NS3 de HCV y su cofactor asociado, NS4A, procesa la región de las proteínas no estructurales víricas para producir proteínas no estructurales individuales [C. Failla et al., “An amino-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 protease is essential for interaction with NS4A”, J. Virol., 69, pp. 1769-1777; Y. Tanji et al., “Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing”, J. Virol., 69, pp. 1575-1581; C. Lin et al., “A central region in the hepatitis C virus NS4A protein allows formation of an active NS3-NS4A serine proteinase complex in vivo and in vitro”, J. Virol., 69, pp. 4373-4380], y es fundamental para la replicación vírica. Este procesamiento parece ser análogo al que lleva a cabo la aspartil proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, que también está implicada en el procesamiento de proteínas víricas. Los inhibidores de la proteasa del VIH, que inhiben el procesamiento de proteínas víricas, son potentes agentes antivíricos en seres humanos, lo cual indica que la interrupción de esta etapa del ciclo vital del virus produce agentes terapéuticamente activos. Por consiguiente, es una diana atractiva para el descubrimiento de fármacos. Véase, por ejemplo, Lahm et al., Curr. Drug Targets, 3, pp. 281-296 (2002) , que describe la proteasa NS3 de HCV como una diana potencial para el desarrollo de inhibidores de molécula pequeña.

En la técnica anterior se han descritos varios inhibidores de la proteasa de HCV potenciales [publicaciones PCT nº WO 02/18369, WO 02/08244, WO 00/09588, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 90/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, WO 98/46630, WO 98/17679 y WO 97/43310, patente de EEUU 5.990.276, M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713-1718 (1998) ; W. Han et al., Bioor. Med. Chem. Lett., 10, 711-713 (2000) ; R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571-1579 (2000) ; M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267-2270 (2000) ; y S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Lett., 10, pp. 2271-2274 (2000) ]. Sin embargo, no se sabe si estos compuestos tendrían los perfiles apropiados para ser fármacos aceptables. Además, es posible que la proteasa de HCV se haga resistente a un fármaco que, por lo demás, sea aceptable. Se han descrito mutantes de proteasa. Véase, por ejemplo, Trozzi et al., J. Virol., 77, pp. 3669-3679 (2003) , que describe una proteasa NS3/4A de HCV que tiene una mutación puntual en la posicion 168, y la publicación de patente internacional WO 2004/039970, que describe proteasas NS3/4A de HCV que tienen sustituciones, por ejemplo, en las posiciones de los aminoácidos, 26, 41, 71, 89, 101, 150, 155, 168, 176 o 179.

Por tanto, el conocimiento actual del HCV no ha conducido a ningún agente o tratamiento anti-HCV satisfactorio. La única terapia establecida para la enfermedad del HCV es un tratamiento basado en interferón alfa. Sin embargo, los interferones alfa tienen significativos efectos secundarios [M.A. Walker et al., “Hepatitis C Virus: An Overview of Current Approaches and Progress”, DDT, 4, pp. 518-529 (1999) ; D. Moradpour et al., “Current and Evolving Therapies for Hepatitis C”, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199-1202 (1999) ; H.L.A. Janssen et al., “Suicide Associated with Alpha-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis”, J. Hepatol., 21, pp. 241-243 (1994) ; P.F. Renault et al., “Side Effects of Alpha Interferon”, Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273-277 (1989) ] e inducen una remisión a largo plazo sólo en una parte (aproximadamente 25%) de los casos [O.... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica una proteasa NS3/4A de HCV, o su fragmento biológicamente activo o su análogo biológicamente activo, en el que el codón que corresponde al codón 156 de un polinucleótido de NS3/4A de HCV de tipo salvaje está mutado de modo que codifica una serina.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicacion 1, en el que el polinucleótido codifica una proteasa NS3/4A de HCV,

o su fragmento biológicamente activo o su análogo biológicamente activo, que es resistente a un inhibidor de

proteasas. 3. El polinucleótido aislado de la reivindicacion 1, en el que el polinucleótido de HCV de tipo salvaje comprende una secuencia de SEQ ID NO:1.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicacion 1 o la reivindicación 2, que comprende una secuencia de un ácido nucleico que codifica una proteasa NS3/4A de HCV, en el que el codón que corresponde alcodón 156 de un polinucleótido de NS3/4A de HCV de tipo salvaje está mutado de modo que codifica una serina.

5. Una proteína de la proteasa NS3/4A de HCV aislada, o su fragmento biológicamente activo o su análogo biológicamente activo, que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoácido que corresponde al aminoácido 156 de la proteasa NS3/4A de HCV de tipo salvaje es una serina.

6. La proteína de la proteasa NS3/4A de HCV aislada de la reivindicación 5, que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el resto aminoácido que corresponde al aminoácido 156 de la proteasa NS3/4A de HCV de tipo salvaje es una serina.

7. La proteína de la proteasa NS3/4A de HCV aislada, o su fragmento biológicamente activo o su análogo biológicamente activo, de la reivindicación 5, en la que la proteína de la proteasa NS3/4A de HCV aislada, o su fragmento biológicamente activo o su análogo biológicamente activo, es resistente a un inhibidor de proteasas.

8. La proteína de la proteasa NS3/4A de HCV aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que dicha proteasa NS3/4A de HCV de tipo salvaje comprende una secuencia de SEQ ID NO:2. 9. Un vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4. 10. Una célula o una línea celular hospedante, que comprende:

a) el polinucleótido según una cualquiera de las reivindincaciones 1-4, o

b) la proteína, el fragmento o el análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

11. Una célula hospedante transformada o transfectada con un vector de la reivindicación 9.

12. Un HCV aislado, que comprende:

a) el polinucleótido según una cualquiera de las reivindincaciones 1-4, o

b) la proteína, el fragmento o el análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

13. Una composición que comprende:

a) el polinucleótido según una cualquiera de las reivindincaciones 1-4, o

b) la proteína, el fragmento o el análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

14. Un método para detectar la presencia de un HCV resistente a fármacos en una muestra biológica, que comprende detectar la presencia del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en dicha muestra biológica.

15. El método según la reivindicación 14, que comprende:

a) obtener dicho polinucleótido a partir de dicha muestra,

b) determinar la secuencia del polinucleótido, y

c) determinar si un codón de dicho polinucleótido que corresponde al codón 156 del polinucleótido de la proteasa

NS3/4A de HCV de tipo salvaje codifica una serina.

16. Un método para determinar si una infección por HCV en un paciente es resistente a fármacos, que comprende: evaluar si una muestra biológica recogida de un paciente infectado por HCV contiene un polinucleótido según una

cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la presencia de un polinucleótido según una cualquiera de las

reivindicaciones 1-4 es indicativa de que dicho paciente tiene una infección por HCV resistente a fármacos.

17. Un método para evaluar si un paciente infectado por HCV tiene una menor sensibilidad o susceptibilidad a VX950, que comprende evaluar in vitro si dicho paciente tiene un ADN de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C que tiene una mutación en el codón que codifica el aminoácido 156 de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C de tipo salvaje.

18. Un método para evaluar si un paciente infectado por HCV tiene una menor sensibilidad o susceptibilidad a un inhibidor de proteasas, que comprende evaluar in vitro si dicho paciente tiene un ADN de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C que tiene una mutación en el codón que codifica el aminoácido 156 de la proteasa NS3/4A del virus de la hepatitis C de tipo salvaje.

19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 17-18, en el que la mutación se correlaciona o produce

una menor sensibilidad o susceptibilidad a BILN 2061. 20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 17-18, en el que la mutación se correlaciona o produce una menor sensibilidad o susceptibilidad a VX-950 y a BILN 2061.

21. Un método para evaluar un inhibidor de HCV candidato o potencial, que comprende:

a) introducir un vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un gen indicador que codifica un indicador, en una célula hospedante; b) cultivar la célula hospedante; y c) medir el indicador en presencia del inhibidor y en ausencia del inhibidor.

22. Un método para ensayar un inhibidor de HCV candidato o potencial para la actividad contra HCV, que

comprende: a) proporcionar una proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, y un sustrato de proteasa;

b) poner en contacto la proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo, con un inhibidor candidato o potencial en presencia del sustrato; y

c) evaluar o medir la inhibición de la actividad proteolítica de la proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo.

23. Un método para identificar un compuesto eficaz como inhibidor de una proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, que comprende:

a) ensayar la actividad de la proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo, en ausencia del compuesto; b) ensayar la actividad de la proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo, en presencia del compuesto; y c) comparar los resultados de a) y los resultados de b) .

24. Un método para identificar un compuesto capaz de rescatar la actividad de VX-950, en el que una proteasa

NS3/4A de HCV se ha hecho resistente a VX-950, que comprende: a) poner en contacto una proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, con el compuesto;

b) ensayar la capacidad de VX-950 para inhibir la actividad de la proteína de proteasa, o su fragmento o su

análogo de a) , en presencia del compuesto.

25. Un método para identificar un compuesto eficaz contra una proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, que comprende:

a) obtener un modelo tridimensional de la proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo, en el que el modelo tridimensional está basado en la estructura cristalina de rayos X (figura 1 y figura 2) de la proteasa NS3/4A;

b) diseñar o seleccionar un compuesto que interacciona con el modelo tridimensional; y c) evaluar la capacidad del compuesto para unirse o interaccionar con la proteína de proteasa, o su fragmento o su análogo.

26. El método según la reivindicación 25, en el que el modelo se obtiene mediante métodos informáticos.

27. El método según la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en el que la evaluación se realiza mediante la formación de modelos moleculares.

28. El método según una cualquiera de las reivindicacione.

2. 27, en el que dicho compuesto es un compuesto preparado mediante el diseño racional de fármacos y se deriva de la estructura de VX-950.

FIGURA 1 FIGURA 2

FIGURA 7