SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA CONTROLAR LA HIBRIDACION DURANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA.

ESTOS PROCEDIMIENTOS SE LLEVAN A CABO A TRAVES UN CICLADO TERMICO RAPIDO Y DEL USO DE COLORANTES DE ADN DE DOBLE FILA Y DE SONDAS DE HIBRIDACION ESPECIFICAS. UN PAR DE TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE RESONANCIA POR FLUORESCENCIA COMPRENDE FLUORESCEINA Y CY5 O CY5,5. LOS PROCEDIMIENTOS PARA CUANTIFICAR UN ADN AMPLIFICADO Y DETERMINAR SU PUREZA SE LLEVAN A CABO MEDIANTE UN ANALISIS DE LAS CURVAS DE FUSION Y DE RECOCIDO POR SEGUNDA VEZ.

Motorización de la hibridación durante la PCR.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la observación de señales de fluorescencia que resultan de la hibridación conjuntamente con la reacción en cadena de la polimerasa. Más específicamente, la presente invención se refiere a la observación de la hibridación con fluorescencia durante y/o inmediatamente después de la PCR y la utilización de esta información para la identificación, la detección de alteraciones de secuencias, y la cuantificación del producto.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es fundamental para la biología molecular y es la primera técnica molecular práctica para el laboratorio clínico. A pesar de su utilidad y popularidad, la comprensión actual de la PCR no está muy avanzada. Las condiciones adecuadas para amplificaciones satisfactorias se deben encontrar mediante prueba y error y la optimización es empírica. Incluso los expertos en la materia necesitan utilizar una técnica potente sin una teoría explicativa o predictiva del proceso.

La PCR se consigue mediante el ciclado de temperaturas de la muestra, que provoca la desnaturalización (separación) del ADN, la unión (fijación) de cebadores específicos, y la existencia (extensión) de replicación. Un ciclo de la PCR se realiza habitualmente entre 2 y 8 minutos, requiriendo de 1 a 4 horas para una amplificación de 30 ciclos. La respuesta de la temperatura de la muestra en la mayoría de la instrumentación para PCR es muy lenta en comparación con los tiempos necesarios para la desnaturalización, fijación y extensión. Las reacciones físicas (desnaturalización y fijación) y enzimáticas (extensión) en la PCR tienen lugar muy rápidamente. Los tiempos de amplificación para PCR se pueden reducir desde horas a menos de 15 minutos. En el presente documento se incorpora como referencia en su totalidad el documento Nº de Serie de Estados Unidos 08/537.612, solicitado el 2 de octubre de 1995, que da a conocer un sistema de ciclado rápido de este tipo. Las técnicas de ciclado rápido son posibles mediante la respuesta rápida de la temperatura y la homogeneidad de temperatura posibles para muestras en contenedores de muestras con una relación de área superficial-volumen elevada, tales como tubos capilares. Para mayor información, véanse también: C.T. Wittwer. G.B. Reed, y K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification (Amplificación de ADN por ciclado rápido), en K.B. Mullis, F. Ferre, y R.A. Gibbs, The polymerase chain reaction (La reacción en cadena de la polimerasa), Birkhauser, Boston, 174-181 (1994). Una mejor homogeneidad de la temperatura permite que los requerimientos del tiempo y la temperatura de la PCR estén mejor definidos y se entiendan mejor. Una mejor homogeneidad de la temperatura también incrementa la precisión de cualquier técnica analítica utilizada para monitorizar la PCR durante la amplificación.

La fluorimetría es una técnica sensible y versátil con muchas aplicaciones en biología molecular. Durante muchos años se ha utilizado bromuro de etidio para monitorizar la distribución de tamaños de ácidos nucleicos separados por electroforesis en gel. El gel se transilumina habitualmente con luz ultravioleta y se observa la fluorescencia roja del ácido nucleico de doble cadena. Específicamente, el bromuro de etidio se utiliza normalmente para analizar los productos de la PCR después de completar la amplificación. Además, la patente EPA 0 640 828 A1 de Higuchi y Watson da a conocer la utilización de bromuro de etidio durante la amplificación para monitorizar la cantidad de ADN de doble cadena mediante la medición de la fluorescencia en cada ciclo. Se observó que la intensidad de la fluorescencia aumentaba y disminuía inversamente con la temperatura, era máxima a la temperatura de fijación/extensión (50ºC), y mínima a la temperatura de desnaturalización (94ºC). En cada ciclo se obtuvo la máxima fluorescencia como una medida de la cantidad de ADN. La aplicación de Higuchi y Watson no enseña la utilización de la fluorescencia para monitorizar las hibridaciones, ni sugiere la medición de fluorescencia a diferentes temperaturas para seguir la extensión de la hibridación. Además, Higuchi y Watson no enseñan ni sugieren la utilización de la dependencia con la temperatura de la hibridación del producto de la PCR para la identificación o cuantificación de productos de la PCR.

Sin embargo, la aplicación de Higuchi y Watson no menciona la utilización de otros fluoróforos, que incluyen sistemas de sondas doblemente marcadas que generan fluorescencia cuando se hidrolizan mediante la actividad de la 5'-exonucleasa de ciertas polimerasas de ADN, tal como se da a conocer en la Patente de Estados Unidos No. 5.210.015 de Gelfand y otros. La fluorescencia observada a partir de estas sondas depende, principalmente, de la hidrólisis de la sonda entre sus dos fluoróforos. La cantidad de producto de la PCR se estima mediante la medición de la fluorescencia una vez por ciclo. A pesar de que la hibridación de estas sondas parece que es necesaria para que tenga lugar la hidrólisis, la señal de fluorescencia surge, principalmente, de la hidrólisis de las sondas, sin hibridación, en la que una sonda de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes en los extremos opuestos del mismo proporciona un sistema de sondas de inhibición útiles para detectar el producto de PCR y la hibridación de ácido nucleico. K.J. Livak y otros, 4 PCR Math. Appl. 357-362 (1995). No se sugiere el seguimiento de la dependencia de la temperatura de la hibridación de la sonda con fluorescencia para identificar las alteraciones de las secuencias en productos de la PCR.

Se ha explotado en muy diferentes formatos la hibridación específica de un ácido nucleico a una cadena complementaria para la identificación. Por ejemplo, después de la digestión de la enzima de restricción, el ADN genómico se puede fraccionar por tamaño e hibridar a sondas mediante una transferencia de Southern. Como ejemplo adicional, se pueden detectar mutaciones de bases únicas mediante "transferencias de puntos" con oligonucleótidos específicos de alelo. Habitualmente, la hibridación se realiza durante minutos a horas a una temperatura única para conseguir la discriminación necesaria. Como alternativa, la extensión de la hibridación se puede monitorizar de forma dinámica mientras cambia la temperatura mediante técnicas de fluorescencia. Por ejemplo, para monitorizar la hibridación se han utilizado curvas de fusión por fluorescencia. L.E. Morrison y L.M. Stols, Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution (Mediciones cinéticas y termodinámicas basadas en la sensibilidad a la fluorescencia de la hibridación de ADN en solución), 32 Biochemistry 3095-3104, 1993). Las velocidades de barrido de temperatura son, habitualmente, de 10ºC/hora o inferior, en parte debido a la elevada masa térmica de la cubeta del fluorímetro.

Los métodos actuales para monitorizar la hibridación requieren mucho tiempo. Si la hibridación se pudiera seguir en segundos en lugar de horas, la hibridación se podría monitorizar durante la amplificación por la PCR, incluso durante una PCR de ciclado rápido. Entre las muchas utilizaciones de la monitorización de la hibridación durante la PCR, tal como se describirá con detalle en el presente documento, se incluyen la identificación y cuantificación del producto, la detección de alteraciones en las secuencias, y el control automático de los parámetros del ciclado de temperatura mediante retroalimentación de la fluorescencia.

La técnica anterior, tal como se ha explicado anteriormente, lleva a cabo un ciclado de temperaturas de forma lenta y empírica. Cuando se necesita el análisis de los productos de la PCR por hibridación, se requieren etapas adicionales que consumen tiempo. De este modo, sería un gran avance en la técnica proporcionar métodos para monitorizar la hibridación durante la PCR y analizar la reacción mientras tiene lugar, es decir, durante o inmediatamente después del ciclado de temperaturas sin manipular la muestra. Mediante la monitorización de la hibridación durante la PCR, los principios subyacentes que permiten el funcionamiento de la PCR se pueden seguir y utilizar para analizar y optimizar la reacción durante la amplificación.

La Patente EP 0640 828A da a conocer un aparato para monitorizar simultáneamente reacciones múltiples de ácidos nucleicos, que utiliza un ciclador y sensor térmico para detectar la luz emitida en las pausas... [Seguir leyendo]

1. Método para analizar una secuencia de ADN diana de una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:

la amplificación de la secuencia diana por la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de una entidad fluorescente que se une al ácido nucleico, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ciclado térmico de la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación;

la excitación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por la entidad fluorescente que se une al ácido nucleico;

la monitorización de la fluorescencia dependiente de la temperatura de la entidad fluorescente que se une al ácido nucleico a medida que cambia la temperatura de la muestra;

la adquisición de una curva de fusión del producto amplificado de dicha etapa de monitorización; y

la realización de un análisis de la curva de fusión para el producto amplificado.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha entidad fluorescente que se une al ácido nucleico comprende un colorante fluorescente que se une a un ácido nucleico de cadena doble.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que la entidad fluorescente que se une al ácido nucleico es SYBR^TM Green I.

4. Método, según la reivindicación 2, en el que dicho fluorescente que se une a un ácido nucleico específico de cadena doble es un miembro seleccionado entre el grupo que comprende SYBR^TM Green I, bromuro de etidio, Picogreen, naranja de acridina, naranja de tiazol, YO-PRO 1 y cromomicina A3.

5. Método, según la reivindicación 1, en el que la entidad fluorescente que se une al ácido nucleico es SYBR^TM Green I, la etapa de excitación incluye la excitación de la muestra biológica con luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR^TM Green I y la etapa de monitorización incluye la monitorización de la fluorescencia dependiente de la temperatura de SYBR^TM Green I.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de monitorización comprende la determinación de un perfil de fusión de la secuencia diana amplificada.

7. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de

8. Método, según la reivindicación 1, en el que

la secuencia de ácido nucleico diana es un fragmento seleccionado de una plantilla de ácido nucleico diana,

la reacción en cadena de la polimerasa se produce en una mezcla de reacción y la mezcla de reacción comprende además una cantidad desconocida de la plantilla de ácido nucleico diana, un segundo par de cebadores de oligonucleótidos configurados para amplificar un fragmento seleccionado de una plantilla de referencia y una cantidad conocida de la plantilla de referencia, donde la amplificación da como resultado un fragmento amplificado de la plantilla diana y un fragmento amplificado de la plantilla de referencia,

la etapa de monitorización incluye la monitorización de la fluorescencia emitida en función de la temperatura para dar como resultado una curva de fusión de los productos amplificados en la que el fragmento amplificado de la plantilla diana y el fragmento amplificado de la plantilla de referencia se funden a diferentes temperaturas;

la conversión de las curvas de fusión a picos de fusión y la determinación de cantidades relativas de la plantilla diana y la plantilla de referencia a partir de dichos picos de fusión; y

el cálculo de la concentración de la plantilla diana en base a la cantidad conocida de la plantilla de referencia y las cantidades relativas de plantilla diana y plantilla de referencia.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que

la amplificación se produce en una mezcla de reacción y los cebadores se configuran para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana para dar como resultado un producto diana amplificado, comprendiendo además la mezcla de reacción,

una plantilla de control positivo y un segundo par de cebadores de oligonucleótidos configurados para amplificar la plantilla de control positivo para dar como resultado un producto de control amplificado,

la etapa de monitorización comprende la monitorización de forma continua de la fluorescencia durante un ciclo de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa para dar como resultado un primer pico de fusión del producto diana amplificado si se amplifica la secuencia de ácido nucleico diana, y un segundo pico de fusión del producto de control amplificado si se amplifica la plantilla de control positivo;

donde la obtención del segundo pico de fusión indica que la reacción en cadena de la polimerasa era operativa, la obtención del primer pico de fusión indica que el fragmento diana seleccionado era amplificable, y la ausencia del primer pico de fusión indica que el fragmento diana seleccionado no era amplificable.

10. Método, según la reivindicación 3, en el que la etapa de amplificación produce productos amplificados y la fluorescencia dependiente de la temperatura se utiliza para identificar los productos amplificados, en el que los productos amplificados se identifican mediante el análisis de las curvas de fusión.

11. Método, según la reivindicación 10, en el que las cantidades relativas de dos o más productos amplificados se determinan mediante el análisis de las curvas de fusión.

12. Método, según la reivindicación 10, en el que las áreas bajo las curvas de fusión se encuentran mediante regresión mínimo-cuadrática no lineal de la suma de gaussianos múltiples.