Procedimiento para modificar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano.

Método de modificación de la sensibilidad de los microorganismos, preferiblemente hongos, al compuesto quitosano. Este método puede aplicarse a la obtención de hongos más resistentes o más sensibles a este compuesto. El método de modificación de la sensibilidad a quitosano comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo, preferiblemente mediante la administración de quitosano en combinación con al menos un compuesto que modifique la fluidez de la membrana plasmática, o mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos.

Procedimiento para modificar la sensibilidad de los microorganismos a quitosano.

La presente invención se refiere a un método para modificar la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano. Este método puede aplicarse a la obtención de hongos más resistentes o más sensibles a este compuesto.

Estado de la técnica anterior

El quitosano es un polímero formado por subunidades de β-1-4-glucosamina, un derivado parcialmente desacetilado de la quitina, que posee efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias, pero no de células de mamífero. Estas propiedades lo convierten en un compuesto antibiótico idóneo para su aplicación en medicina y en la industria alimentaria (Rabea E.I., et al., 2003, BioMacromolecules 4, 1458-1465), aunque también es de utilidad para otros fines, como por ejemplo, para la inducción de la esporulación en hongos empleados como agentes del control biológico (WO2008102044 A1); o para controlar las plagas y enfermedades que afectan a plantas de horticultura y agricultura (US005374627 A), entre otros.

El quitosano ejerce su actividad antibiótica a través del daño en la membrana plasmática de bacterias y hongos, como Saccharomyces cerevisiae y hongos filamentosos (Zakrzewska, A., et al., 2005, Eukaryotic Cell 4:4, 703-715). Se ha sugerido que esto ocurre mediante la interacción de los grupos amino con carga positiva del quitosano con las cargas negativas de los fosfolípidos de la membrana plasmática (El Ghaouth, A. and Azul, J., 1992, Mycological research 96, 769-773).

Las membranas plasmáticas están compuestas principalmente por lípidos, asociados a proteínas y carbohidratos (en forma de glicolípidos y glicoproteínas), y su fluidez depende del tipo de ácidos grasos presentes, en concreto de la longitud de la cadena hidrocarbonada y del grado de insaturación, aunque también del nivel de esteroles y de la naturaleza de otros lípidos constituyentes. En el caso de los hongos, los ácidos grasos son los mismos para todos los hongos, sin embargo, los niveles de cada uno de ellos varía entre las distintas especies.

Los perfiles de los ácidos grasos celulares totales (Haack, S.K., et al., 1994, Applied and Environmental Microbiology 60, 2483-2493) se han utilizado normalmente para estimar biomasa microbiana y para obtener información de la diversidad y del estado nutricional de los microorganismos. El potencial del análisis de los ácidos grasos como herramienta taxonómica para hongos también ha recibido especial atención en estudios recientes (Kaur, A., et al., 2005, Current Science 89, 1103-1112). Estos estudios han demostrado que la comparación de los ácidos grasos es una medida robusta de similitud a nivel inferior a familia.

La sensibilidad de los hongos a quitosano es variable entre los distintos grupos de hongos, siendo más sensibles los hongos fitopatógenos, que los hongos nematófagos y entomopatógenos empleados como agentes de control biológico (Palma-Guerrero, J., et al., 2008, Journal of Applied Microbiology 104, 541-553).

Diversos trabajos se basan en el estudio del efecto de determinadas mutaciones sobre la sensibilidad a quitosano en la levadura S. cerevisiae. Así, la eliminación de genes que codifican proteínas implicadas en el mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática así como diferentes formas de estrés de la membrana, conducen a un aumento en la sensibilidad a quitosano. Otros grupos de hongos sensibles a quitosano son aquellos que portan deleciones en genes implicados en la vía de señalización HOG (high-osmolarity glycerol). Se ha demostrado que las células expuestas a condiciones hipertónicas son ligeramente más resistentes a quitosano, mientras que las condiciones hipotónicas sensibilizan a las células frente al mismo. Deleciones en genes implicados en la síntesis y procesamiento de RNA, en la organización del citoesqueleto de actina, en la N-glicosilación de proteínas, en la síntesis de ergosterol, en la endocitosis o en la formación de la pared celular también se han asociado con un aumento en la sensibilidad al compuesto. Por otro lado, el empleo de drogas como la tunicamicina, miconazol y estaurosporina en combinación con el quitosano, provoca asimismo sensibilidad a este compuesto. También la exposición de las células a 37ºC, temperatura a la que se cree que aumenta la fluidez de la membrana, induce sensibilidad a quitosano (Zakrzewska, A., et al., 2007, Eukaryotic Cell 6:4, 600-608).

Pero no sólo se ha tratado de modificar la sensibilidad a quitosano en levaduras. En bacterias Gram negativas la deleción de genes que intervienen en la ruta de síntesis del ácido teicoico y lipoteicoico, conlleva un aumento en la resistencia a quitosano, debido a la disminución de las cargas negativas en la pared celular (Raafat, D., et al., 2008, Applied and Environmental Microbiology 74:12, 3764-3773).

Debido a la variabilidad en la vulnerabilidad de los microorganismos a quitosano y a las múltiples aplicaciones de este compuesto antibiótico, es necesario disponer de un método que permita modificar la sensibilidad de los mismos.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un método para modificar la sensibilidad de los hongos al compuesto quitosano.

La susceptibilidad a este compuesto está relacionada con la composición de ácidos grasos de la membrana del hongo, por lo que modificando dicha composición o, en general, la fluidez de la membrana plasmática, es posible alterar dicha susceptibilidad.

La fluidez de la membrana puede variar con la composición química de sus componentes. Así, generalmente, la menor longitud o la mayor cantidad de enlaces insaturados de las cadenas de ácidos grasos, hace que las membranas sean más fluidas. Aunque también existen otros componentes presentes en las membranas que influyen en su fluidez, como pueden ser los esteroles o la naturaleza de otros lípidos constituyentes. La disminución de la temperatura también disminuye la fluidez de la membrana. Por tanto, las células podrían alterar la fluidez de sus membranas modificando su composición química. Por ejemplo, algunas bacterias y hongos son capaces de aumentar la concentración de ácidos grasos insaturados (dobles enlaces) a temperaturas bajas, mientras que cuando suben los cambian por ácidos grasos saturados.

Ya que los componentes determinantes de la fluidez de la membrana plasmática, y en concreto el perfil de ácidos grasos, están directamente relacionados con la sensibilidad de los microorganismos, preferiblemente hongos, a quitosano, es posible modificar dicha sensibilidad alterando la fluidez de la membrana, de manera que aumentado la fluidez aumenta la sensibilidad a quitosano y viceversa. Por tanto, la invención se refiere a un método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo.

El quitosano interacciona con la membrana del hongo para ejercer sus efectos inhibitorios sobre el crecimiento, al igual que ocurre en el caso de otros microorganismos, como es el caso de las bacterias. Por ello, mediante la modificación de la fluidez de la membrana de bacterias sería posible modificar la sensibilidad al quitosano, como en el caso de los hongos. En base a esto, aunque los ejemplos de la presente invención pongan de manifiesto la efectividad del método de modificación de la sensibilidad a quitosano en hongos, también podría ser posible aplicarlo a las bacterias. Por ello, en la presente descripción se entiende por "microorganismo" cualquier ser vivo perteneciente al reino Bacteria o al reino Fungi, es decir, bacterias y hongos, entendiéndose como "hongo" tanto hongos filamentosos (mohos) como hongos levaduriformes (levaduras).

La modificación de la fluidez de la membrana se puede realizar por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante cambios en la temperatura exógena, mediante la administración al microorganismo de formulaciones modificadas del quitosano, o de composiciones que comprendan quitosano y otro/s compuesto/s, capaces de modificar dicha fluidez, como por ejemplo, pero sin limitarnos, el DMSO (dimetil sulfóxido, de fórmula química CH₃SOCH₃) o el Alcohol Bencílico, que rigidizan y fluidizan la membrana respectivamente, o mediante sustancias que aumenten la actividad de las enzimas desaturasas. Otra alternativa es la... [Seguir leyendo]

1. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos que comprende modificar la fluidez de la membrana plasmática del microorganismo mediante la inducción de mutaciones en genes que codifican para enzimas desaturasas de ácidos grasos.

2. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano según la reivindicación 1, donde el microorganismo es un hongo.

3. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la enzima desaturasa es: oleoil-Δ12 desaturasa o linoleoil-n3 desaturasa.

4. Método de modificación de la sensibilidad a quitosano en microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la mutación es una deleción.