Métodos para medir complejos inmunosupresores de tacrólimo, sirólimo, y ciclosporina A en una muestra de sangre.

Un método de determinación en un sistema automático de la cantidad máxima de complejos inmunosupresores,

que comprenden un fármaco inmunosupresor, un componente sanguíneo proteína de unión, y un componente sanguíneo proteína diana, que pueden ser formados potencialmente por un fármaco inmunosupresor en un paciente que experimente terapia inmunosupresora con el fármaco, donde el método comprende las etapas de:

a) lisar una muestra de sangre obtenida del paciente para obtener componentes sanguíneos;

b) dividir la muestra lisada de sangre que contiene los componentes sanguíneos en primeras y segundas alícuotas iguales y colocar la primera alícuota en un primer recipiente y la segunda alícuota en un segundo recipiente;

c) añadir al segundo recipiente un volumen de matriz y un exceso del fármaco inmunosupresor que se esté utilizando en la terapia inmunosupresora del paciente;

d) añadir al primer recipiente el mismo volumen de matriz que se añadió al segundo recipiente en (c) sin añadir un exceso del fármaco inmunosupresor;

e) poner en contacto separadamente los contenidos del primer recipiente de la etapa (d) y del segundo recipiente de la etapa (c) con una superficie sólida igual etiquetada con un primer anticuerpo, que es específico para un componente sanguíneo del complejo inmunosupresor con el fármaco inmunosupresor, después de lo cual el complejo inmunosupresor se une mediante el primer anticuerpo sobre la superficie sólida;

f) lavar cada uno de ambos recipientes para eliminar los componentes que no han reaccionado y los interferentes,

g) poner en contacto la superficie sólida con un segundo anticuerpo, que está marcado con un marcador de detección y que es específico para otro componente sanguíneo del complejo inmunosupresor con el fármaco inmunosupresor, después de lo cual el complejo inmunosupresor se une mediante el segundo anticuerpo;

h) medir (i') la cantidad de marcador de detección sobre el segundo anticuerpo, que se une al complejo inmunosupresor del primer recipiente que se une mediante el primer anticuerpo, y (ii') la cantidad de marcador de detección sobre el segundo anticuerpo, que se une al complejo inmunosupresor del segundo recipiente que se había unido mediante el primer anticuerpo, donde (i') es proporcional a los complejos inmunosupresores reales totales formados con el fármaco inmunosupresor, y (ii') es proporcional a los complejos inmunosupresores máximos teóricos que se pueden formar con el fármaco inmunosupresor en exceso; e

i) determinar la diferencia entre la cantidad de complejos inmunosupresores reales totales formados y la cantidad de complejos inmunosupresores máximos teóricos formados, donde la diferencia representa el incremento de la cantidad de complejos inmunosupresores que se pueden formar potencialmente en el paciente que experimenta terapia inmunosupresora con el fármaco inmunosupresor.

Métodos para medir complejos inmunosupresores de tacrólimo, sirólimo, y ciclosporina A en una muestra de sangre Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y análisis diagnósticos para determinar las cantidades de complejos inmunosupresores que contienen (individualmente o combinados) los fármacos inmunosupresores tacrólimo, sirólimo o ciclosporina A en una muestra de sangre.

Antecedentes de la Invención La ciclosporina A (CsA) , el tacrólimo (FK506, Prograf®) y el sirólimo (rapamicina) son fármacos inmunosupresores potentes que inhiben la proliferación de linfocitos T. La acción de estos fármacos está mediada por proteína intracelulares denominadas inmunofilinas. Estas inmunofilinas son rotamasas (enzimas implicadas en el plegamiento de las proteínas) .

El Sirólimo y el tacrólimo comparten homología estructural, y un dominio de unión inhibidor sobre una familia de inmunofilinas, denominadas proteínas de unión FK506 o FKBP (Abraham et al., Ann Rev. Immunol. Vol. 14, 483 (1996) ) . La ciclosporina A se une a la ciclofilina, otra inmunofilina y la inhibe. Formando complejo con las proteínas de unión, estos fármacos inhiben las dianas secundarias que regulan las rutas de transducción de la señal y dan como resultado una inhibición del progreso del ciclo de las células inmunitarias. Estas rutas median y regulan la inmunosupresión deseada. Estos y otros factores y rutas también producen sistémicamente los efectos no deseables de los fármacos por medio de las células inmunitarias y otros tipos de células.

El sirólimo y tacrólimo interaccionan ambos con FKBP12, un miembro de las inmunofilinas FKBP, que es expresada en la sangre humana. Los dímeros de sirólimo/FKBP12 y de tacrólimo/FKBP12 forman complejos e inhiben moléculas diana separadas. La diana del dímero sirólimo/FKBP12 se denomina Diana de Rapamicina en Mamíferos (mTOR) . El dímero de tacrólimo/FKBP12 se dirige a la Calcineurina ( (Abraham et al., (más arriba) ; Chung et al., Cell Vol. 69, 1227 (1992) ) . El dímero de ciclosporina A-ciclofilina y el dímero de tacrólimo/FKBP12 por separado pueden formar un complejo pentamérico e inhiben una diana común, la Calcineurina, una serina/treonina fosfatasa.

La unión del dímero de sirólimo/FKBP12 a mTOR inhibe el progreso del ciclo celular de las células T. En las células T la Calcineurina/Calcio/Calmodulina unida al complejo de tacrólimo/FKBP12 o al complejo de Ciclosporina A/ciclofilina evita la desfosforilación, y de este modo, reduce la activación de numerosas moléculas de transducción de señales sistémicas, incluyendo NFAT que estimula la transcripción del modulador inmunitario interleuquina-2 (IL2) . Los efectos inmunosupresores de estos fármacos se logran por medio de los complejos multiméricos descritos previamente formados por estos fármacos con sus proteínas de unión, sus dianas (las enzimas que inhiben) , y otros cofactores requisito. El tacrólimo tiene un intervalo terapéutico reducido, debido a esto, el control de los niveles de tacrólimo en pacientes que experimentan una terapia inmunosupresora con tacrólimo es una práctica convencional. Los métodos actuales miden la concentración total de fármaco en sangre (formando complejo y sin formar complejo) . La Patente de los Estados Unidos Núm. 6.338.946 hace referencia a métodos para el análisis manual de fármacos inmunosupresores (con actividad inhibidora de calcineurina) in vitro, esto es, que forman un complejo de tacrólimo aislado con fármaco inmunosupresor con componentes de unión exógenos, inmunofilina específica implicada, calcineurina bovina, calmodulina, calcio) , en un recipiente sólido y detectando el complejo con un anticuerpo anti-calcineurina etiquetado para un sistema de detección. Otros métodos disponibles extraen el tacrólimo de muestras de sangre obtenidas de pacientes que reciben tacrólimo, y miden la cantidad de tacrólimo extraído formando complejos in vitro como se ha descrito más arriba ( (Amstrong et al., Clin. Chemistr y Vol. 44, páginas 2516-2523 (1998) ) . Estas mediciones se comparan después con intervalos de concentración de toxicidad del fármaco determinadas demográficamente y se utilizan para estimar los efectos tóxicos potenciales.

Se ha demostrado que existe una carencia de correlación entre la concentración total de fármaco y la inmunosupresión; por lo tanto la medición de la concentración en sangre total del fármaco no es predictiva de respuestas de inmunosupresión individuales. La variabilidad en la respuesta al fármaco inmunosupresor se ha atribuido al descubrimiento de varios factores: metabolitos inactivos de los fármacos de origen que experimentan reacción cruzada con los anticuerpos específicos para los fármacos de origen en los análisis, metabolitos activos del fármaco de origen que no se unen al anticuerpo del análisis (y no se miden) , y en gran parte al hecho de que estos análisis miden el fármaco de origen total en una muestra, en lugar de los complejos inmunosupresores funcionales. Se debe tener en cuenta que tacrólimo, sirólimo, y Ciclosporina A y sus metabolitos activos actúan como inmunosupresores solamente cuando forman complejos multiméricos con sus inmunofilinas de unión concretas y las enzimas diana implicadas en la inmunosupresión celular.

Cada paciente tiene diferentes concentraciones en sangre de estas proteínas de unión y componentes diana (debido a la edad, género, raza, afecciones, etc.) . De este modo, la capacidad para formar complejos inmunosupresores y el número de complejos formados en presencia de cada uno de estos fármacos está determinado de manera única (genéticamente, y/o medioambientalmente) en cada paciente individual. Por lo tanto, cada paciente tiene un grado único de respuesta inmunosupresora, que depende en parte de la presencia y la abundancia de los componentes requeridos para formar los complejos inmunosupresores.

Cuando se tratan los pacientes con estos fármacos inmunosupresores hidrófobos, una parte del fármaco se une a proteínas de unión funcionales y afecta a las rutas de transducción de las señales inmunosupresoras, pero una fracción significativa de fármaco se une de manera no específica a proteínas, lípidos, y membranas, quedando aislada de las células inmunitarias en las que tiene lugar la acción inmunosupresora. La medición de la concentración total en sangre del fármaco inmunosupresor con los métodos disponibles en la actualidad conduce a una sobrestimación de la cantidad de fármaco funcional presente en la sangre debido a que estos métodos miden también el fármaco funcionalmente inactivo implicado en la inmunosupresión (Alak, A., Therap. Fármaco, Monit., Vol. 19, páginas 338-351 (1997) . Adicionalmente, los métodos actuales que miden los metabolitos activos del fármaco de origen carecen de correlación entre su actividad farmacéutica y sus reactividades cruzadas inmunológicas (Amstrong et al., Clin. Chemistr y Vol. 44, páginas 2516-2523 (1998) ) . También es importante mencionar que los métodos actuales que miden los fármacos inmunosupresores totales en la sangre de un paciente se utilizan para pronosticar los efectos tóxicos potenciales, no para medir efectos terapéuticos inmunosupresores.

En vista de lo anterior, existe la necesidad de métodos de análisis que permitan la cuantificación de los complejos inmunosupresores funcionalmente activos, esto es, complejos formados en la propia sangre del paciente. Se piensa, sin estar vinculado a una teoría, que por medio de esta cuantificación, se proporcionará una estimación de las proteínas de unión específicas y los componentes diana, una estimación de la inmunosupresión potencial antes, o durante la terapia con el inmunosupresor. Específicamente, en pacientes que no han comenzado la terapia con el inmunosupresor, la cuantificación de los complejos inmunosupresores funcionalmente activos podría ayudar a seleccionar el tratamiento con el fármaco más apropiado específico para cada paciente basándose en la capacidad del paciente para formar complejos activos con tacrólimo, sirólimo o ciclosporina A, o combinaciones de los mismos, sin someter al paciente a efectos de fármacos tóxicos innecesarios causados por los métodos de selección de fármacos de prueba y error actuales. En los pacientes que ya se encuentran bajo terapia con inmunosupresores, la cuantificación de los complejos inmunosupresores máximos teóricos puede permitir una correlación más fiable entre la fracción farmacológicamente activa del fármaco en sangre y la inmunosupresión observada in vivo en el paciente. Por medio de la adición de cantidades saturantes de fármaco a una muestra... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinación en un sistema automático de la cantidad máxima de complejos inmunosupresores, que comprenden un fármaco inmunosupresor, un componente sanguíneo proteína de unión, y un componente sanguíneo proteína diana, que pueden ser formados potencialmente por un fármaco inmunosupresor en un paciente que experimente terapia inmunosupresora con el fármaco, donde el método comprende las etapas de:

a) lisar una muestra de sangre obtenida del paciente para obtener componentes sanguíneos; b) dividir la muestra lisada de sangre que contiene los componentes sanguíneos en primeras y segundas alícuotas iguales y colocar la primera alícuota en un primer recipiente y la segunda alícuota en un segundo recipiente; c) añadir al segundo recipiente un volumen de matriz y un exceso del fármaco inmunosupresor que se esté utilizando en la terapia inmunosupresora del paciente; d) añadir al primer recipiente el mismo volumen de matriz que se añadió al segundo recipiente en (c) sin añadir un exceso del fármaco inmunosupresor; e) poner en contacto separadamente los contenidos del primer recipiente de la etapa (d) y del segundo recipiente de la etapa (c) con una superficie sólida igual etiquetada con un primer anticuerpo, que es específico para un componente sanguíneo del complejo inmunosupresor con el fármaco inmunosupresor, después de lo cual el complejo inmunosupresor se une mediante el primer anticuerpo sobre la superficie sólida; f) lavar cada uno de ambos recipientes para eliminar los componentes que no han reaccionado y los interferentes, g) poner en contacto la superficie sólida con un segundo anticuerpo, que está marcado con un marcador de detección y que es específico para otro componente sanguíneo del complejo inmunosupresor con el fármaco inmunosupresor, después de lo cual el complejo inmunosupresor se une mediante el segundo anticuerpo; h) medir (i') la cantidad de marcador de detección sobre el segundo anticuerpo, que se une al complejo inmunosupresor del primer recipiente que se une mediante el primer anticuerpo, y (ii') la cantidad de marcador de detección sobre el segundo anticuerpo, que se une al complejo inmunosupresor del segundo recipiente que se había unido mediante el primer anticuerpo, donde (i') es proporcional a los complejos inmunosupresores reales totales formados con el fármaco inmunosupresor, y (ii') es proporcional a los complejos inmunosupresores máximos teóricos que se pueden formar con el fármaco inmunosupresor en exceso; e i) determinar la diferencia entre la cantidad de complejos inmunosupresores reales totales formados y la cantidad de complejos inmunosupresores máximos teóricos formados, donde la diferencia representa el incremento de la cantidad de complejos inmunosupresores que se pueden formar potencialmente en el paciente que experimenta terapia inmunosupresora con el fármaco inmunosupresor.

2. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de sangre se recogió en un recipiente tratado con anticoagulante.

3. El método de la reivindicación 2, donde el recipiente tratado con anticoagulante es un recipiente sin EDTA.

4. El método de la reivindicación 3, donde los glóbulos rojos y las células inmunitarias se separan antes de lisar la muestra de sangre.

5. El método de la reivindicación 1, donde las etapas (c) a (i) se logran utilizando medios automáticos.

6. El método de la reivindicación 5, donde la superficie sólida comprende micropartículas.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicho fármaco inmunosupresor es el tacrólimo.

8. El método de la reivindicación 7, donde el anticuerpo unido a las micropartículas de la etapa (e) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-FKBP 12 y anticuerpo anti-Calcineurina A o B; el anticuerpo marcado con un marcador de detección de la etapa (g) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-FKPB12 y anticuerpo anti-Calcineurina A o B; y el marcador de detección de la etapa (g) se selecciona del grupo que consiste en acridinio, luminol, peroxidasa de rábano picante, fluoresceína, fosfatasa alcalina y una radiomarca.

9. El método de la reivindicación 6, donde dicho fármaco inmunosupresor es el sirólimo.

10. El método de la reivindicación 9 donde, el anticuerpo unido a las micropartículas de la etapa (e) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-FKPB12 y anticuerpo anti-mTOR; el anticuerpo marcado con un marcador de detección de la etapa (g) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-FKPB12 y anticuerpo ante mTOR; y el marcador de detección de la etapa (g) se selecciona del grupo que consiste en acridinio, luminol, peroxidasa de rábano picante, fluoresceína, fosfatasa alcalina y una radiomarca.

11. El método de la reivindicación 6, donde dicho fármaco inmunosupresor es la Ciclosporina A.

12. El método de la reivindicación 11, donde el anticuerpo unido a las micropartículas de la etapa (e) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-ciclofilina y anticuerpo anti-Calcineurina A o B; el anticuerpo marcado con a marcador de detección de la etapa (g) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo anti-Ciclofilina y anticuerpo anti-Calcineurina A o B; y el marcador de detección de la etapa (g) se selecciona del grupo que consiste en acridinio, luminol, peroxidasa de rábano picante, fluoresceína, fosfatasa alcalina y una radiomarca.

13. El uso de un método de acuerdo con la reivindicación 1 para seleccionar una cantidad adicional de fármaco inmunosupresor que se va a administrar a un paciente bajo tratamiento, que tiene un efecto inmunosupresor insuficiente, donde dicho fármaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en tacrólimo, sirólimo y ciclosporina A.

14. Un método de para medir en un sistema automático las proporciones relativas de complejos inmunosupresores, que comprenden un fármaco inmunosupresor, un componente sanguíneo proteína de unión, y un componente sanguíneo proteína diana, formados por un primer fármaco inmunosupresor y un segundo fármaco inmunosupresor en una muestra de sangre de un paciente que recibe tratamiento dual con fármacos inmunosupresores, donde el método comprende las etapas de:

a) lisar una muestra de sangre del paciente para obtener componentes sanguíneos; b) dividir la muestra de sangre lisada que contiene los componentes sanguíneos en primeras y segundas alícuotas iguales y colocar la primera alícuota en un primer recipiente y la segunda alícuota en un segundo recipiente; c) poner en contacto separadamente los contenidos del primer recipiente de la etapa (b) con una superficie sólida etiquetada con un primer anticuerpo, que es específica para un componente sanguíneo en el complejo inmunosupresor con el primer fármaco inmunosupresor, y los contenidos del segundo recipiente de la etapa (b) con una superficie sólida etiquetada con un segundo anticuerpo, que es específico para un componente sanguíneo en el complejo inmunosupresor con el segundo fármaco inmunosupresor; d) lavar cada uno de ambos recipientes para eliminar los componentes que no han reaccionado y los interferentes; e) añadir al primer recipiente un tercer anticuerpo, que está marcado con un marcador de detección y que es específico para el complejo inmunosupresor que está siendo medido, donde el tercer anticuerpo es diferente del primer anticuerpo y es específico para otro componente sanguíneo del complejo inmunosupresor con el fármaco inmunosupresor; f) añadir al segundo recipiente un cuarto anticuerpo, que está marcado con un marcador de detección y que es específico para el complejo inmunosupresor que esté siendo marcado, donde el cuarto anticuerpo es diferente del segundo anticuerpo y es específico para otro componente sanguíneo del complejo inmunosupresor con el fármaco inmunosupresor; y g) comparar las cantidades del marcador de detección en el primer recipiente y el segundo recipiente con patrones de calibración apropiados para obtener las proporciones relativas de los complejos inmunosupresores formados por cada uno de los fármacos inmunosupresores utilizados en el tratamiento dual.

15. El método de la reivindicación 14, donde el primer y segundo fármacos inmunosupresores se seleccionan del grupo que consiste en tacrólimo, sirólimo y ciclosporina A.

16. El método de la reivindicación 15, donde la superficie sólida comprende micropartículas.

17. El uso del método de acuerdo con la reivindicación 15 para determinar el complejo inmunosupresor, y la cantidad del mismo, de cada uno de los dos fármacos inmunosupresores utilizados en el tratamiento dual.