MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y DIAGNOSIS DE LA INFECCIÓN POR TRYPANOSOMA CRUZI.

Métodos para la Detección y Diagnosis de la Infección por Trypanosoma cruzi Campo de la Invención La presente invención se refiere a la diagnosis de la infección por Trypanosoma cruzi. Más específicamente, la presente invención se refiere a los métodos para identificar y diagnosticar la infección por Trypanosoma cruzi utilizando una combinación novedosa de cuatro polipéptidos recombinantes. Antecedentes de la Presente Invención El Trypanosoma cruzi ("T. cruzi"), el parásito protozoico que ocasiona la enfermedad de Chagas, o tripanosomiasis Americana, es endémico en América Central y del Sur así como en México. La mayor parte de las personas infectadas, después de una fase aguda suave, entran en la fase indeterminada de larga vida que se caracteriza por la carencia de síntomas, parasitemias bajas, y anticuerpos para una variedad de antígenos de T. cruzi. Aproximadamente 10-30% de las personas con infecciones crónicas por T. cruzi, sin embargo, desarrollan disfunción cardíaca o gastrointestinal como consecuencia de la presencia persistente del parásito. La quimioterapia es en gran parte ineficaz, concretamente para las infecciones crónicas. Aproximadamente 25.000 de las 12 millones de personas estimadas en los países endémicos que están infectados crónicamente con T. cruzi mueren de la enfermedad cada año, debido típicamente a alteraciones del ritmo cardíaco o insuficiencia congestiva del corazón (Véase, Kirchoff, L.V., "American trypanosomiasis (Chagas' disease) in Tropical Infectious Diseases: Principles, Pathogens and Practice, R.L. Guerrant et al., editores, págs. 1082-1094, Churchill Livingstone, Nueva York 2006). En las zonas endémicas el T. cruzi es transmitido principalmente por insectos triatominos chupadores de sangre. La transmisión también se puede producir por transfusión de sangre donada por personas infectadas crónicamente, e históricamente esta ruta de transmisión fue importante en los países endémicos antes de la implementación de los programas de escrutinio de sangre (Véase, Schunis, G.A., Clin. Microbiol. Rev., 18:12-29 (2000)). No existe una vacuna para prevenir la transmisión de T. cruzi. Durante las últimas décadas la emigración de los países endémicos para el Chagas hacia los Estados Unidos ha aumentado notablemente. Aproximadamente 13 millones de tales inmigrantes viven ahora en los Estados Unidos, y se estima que 80.000-120.000 de estas personas están infectadas con T. cruzi (Véase, Kirchoff, L.V., et al., Transfusion, 46:298-304 (2006)). Su presencia crea un riesgo de transmisión del parásito relacionado con transfusiones en los Estados Unidos. Ya se ha informado sobre cinco casos de enfermedad de Chagas relacionada con transfusiones en los estados Unidos, y las autoridades de los bancos de sangre están de acuerdo con que probablemente se haya producido un número mucho mayor de casos no diagnosticados (Véase, Leiby, D.A., et al., N. Engl. J. Med., 341:1237-1239 (1999) y Young, C.T., "Transfusion acquired Trypanosoma cruzi infección," Transfusion, En prensa (2007)). Actualmente las reservas de sangre en los Estados Unidos no son escrutadas en busca de T. cruzi, ya que ningún análisis de escrutinio de sangre ha sido aclarado por la FDA. Por consiguiente, la infección por T. cruzi es una amenaza para las reservas de sangre en los Estados Unidos. También se puede transmitir T. cruzi por medio de transplante de órganos obtenidos de personas infectadas crónicamente. Se ha dado parte de numerosos informes de semejante transmisión en los países endémicos, y no está claro cómo han podido pasar inadvertidos en los Estados Unidos (Véase, Mascola, L., et al., MMWR, 55:798-780 (2006) y Zayas, C.F., et al., MMWP. 51:210-212 (2001)). La diagnosis en laboratorio de la infección crónica por T. cruzi es compleja. La demostración del parásito mediante hemocultivo o xenodiagnosis lleva tiempo, es poco sensible, y es costosa. Por el contrario, los análisis serológicos para los anticuerpos para T. cruzi están bien adaptados a una diagnosis rápida y poco costosa de la infección. Los ensayos convencionales, tales como el análisis de hemaglutinación indirecta ("IHA"), el análisis de inmunofluorescencia indirecta ("IFA"), y el análisis de inmunoabsorción con enzima ligada ("ELISA"), se utilizan ampliamente en los países endémicos. La mayor parte se basa en fracciones antigénicas completas o semipurificadas de epimastigotas de T. cruzi desarrollados en cultivo axénico. Un problema persistente con los análisis convencionales ha sido la aparición de resultados no concluyentes y falsos positivos (Almeida, I.C., et al., Transfusion, 37:850-857 (1997), Kirchoff, L.V., et al., Transfusion, 46:298-304 (2006) y Leiby, D.A., et al., J. Clin. Microbiol., 38:639-642 (2000)). No existe consenso sobre qué preparación de antígeno del parásito es mejor para detectar anticuerpos para T. cruzi. La Organización Panamericana de la Salud y otros grupos expertos han recomendado que la sangre donada sea sometida a ensayo al menos con dos métodos diferentes realizados en paralelo (Véase, "Control of Chagas Disease", World Health Organization, Ginebra (2000)). Este enfoque lleva consigo una enrome carga logística y económica para los bancos de sangre. De este modo, existe la necesidad en la técnica de un análisis adicional para su uso en laboratorios clínicos y bancos de sangre. Ningún análisis ha sido aceptado uniformemente como prueba de oro para la diagnosis serológica de la infección por T. cruzi. Los análisis basados en la PCR carecen de la sensibilidad necesaria para 2 este papel (Véase, Gomes, M.L., Am. J Trop. Med. Hyg., 60:205-210 (1999)). Hace casi dos décadas se desarrolló un análisis de precipitación radioinmunitaria ("RIPA"), que es un ensayo altamente sensible y específico con resultados fácilmente interpretados y ha sido sugerido para su uso como ensayo de confirmación en los Estados Unidos (Véase, Kirchoff, L.V., et al., J. Infect. Dis., 155:561-564 (1987)). Aunque el RIPA ha sido utilizado como análisis de confirmación en más de 20 proyectos de investigación referidos hasta la fecha (Véanse, Kirchoff, L.V., et al., Transfusion, 46:298-304 (2006) y Leiby, D.A., et al., Transfusion, 42:549-555 (2002)), su sensibilidad y especificidad no han sido validadas sistemáticamente. Por otra parte, la complejidad del RIPA haría difícil su amplio uso fuera del entorno de la investigación (Véase, Leiby, D.A., et al., J Clin. Microbiol., 38:639-642 (2000)). 10 También se han estudiado análisis de inmunotransferencia como análisis adicionales para los anticuerpos para T. cruzi. Hace algunos años se propuso un análisis de inmunotransferencia basado en una fracción antigénica de proteína de T. cruzi de epimastigotas unida a una membrana de nitrocelulosa como ensayo adicional para la enfermedad de Chagas (Véase, Mendes, R.P., et al., J. Clin. Microbiol., 35:1829-1834 (1997)). Se ha propuesto un papel similar para un análisis de inmunotransferencia basado en una fracción antigénica excretada-secretada de 15 tripomastigotas ("TESA") producida en cultivos de células de mamífero infectadas por T. cruzi (Véase, Berrizbeitia, M., et al., J. Clin Microbiol., 44:291-296 (2006), Umezawa, E.S., J. Clin. Microbiol., 34:2143-2147 (1996)). El riesgo biológico inherente a la manipulación de cultivos de parásitos vivos y la dificultad de producir estas mezclas antigénicas complejas con regularidad entre lotes son las principales desventajas de los análisis basados en antígenos de cultivos tales como estos dos. Además, ninguno de estos ensayos ha sido adoptado como ensayo de   confirmación y ninguno ha sido desarrollado comercialmente. Otro análisis, concretamente el análisis de Chagas INNO-LIA, contiene siete bandas de ensayo con dominios únicos de T. cruzi sobre una tira de plástico. Sin embargo, el hecho de que se encuentren presentes en la tira siete antígenos recombinantes distintos podría ser un factor limitante en términos de su sensibilidad. Por otra parte, tener siete bandas de ensayo complica el protocolo de interpretación. Por lo tanto, sigue existiendo en la técnica la necesidad de un análisis para T. cruzi que muestre un elevado nivel de sensibilidad y especificidad, que sea simple de interpretar y que sea adecuado para su uso como ensayo de confirmación para especímenes clínicos y de bancos de sangre que son dudosos o reactivos en análisis de escrutinio. Compendio de la Invención En una realización, la presente invención hace referencia a un método de identificación de Trypanosoma cruzi en una muestra de ensayo. El método comprende las etapas de: poner en contacto una muestra de ensayo de un ser humano con los cuatro polipéptidos recombinantes FP3, FP6, FP 10 y TcF; y detectar la unión de los anticuerpos presentes en dicha muestra de ensayo a al menos dos de dichos polipéptidos recombinantes,... [Seguir leyendo]

1. Un método de identificación de Trypanosoma cruzi en una muestra de ensayo, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto una muestra de ensayo de un ser humano con los cuatro polipéptidos recombinantes FP3 [ID SECUENCIA NO: 1], FP6 [ID SECUENCIA NO: 2], FP10 [ID SECUENCIA NO: 3] y TcF [ID SECUENCIA NO: 4], y detectar la unión de los anticuerpos presentes en dicha muestra de ensayo a al menos dos de dichos polipéptidos recombinantes, indicando la presencia de dicha unión de dichos anticuerpos a al menos dos de dichos polipéptidos recombinantes la presencia de Trypanosoma cruzi en dicha muestra de ensayo. 2. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal y orina. 3. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un polipéptido recombinante adicional seleccionado del grupo que consiste en JL8, TCR27, JL7, TCR39, PEP-2, Ag36, JL9, TCNA, TcLo1.2, TS, TcD, TcE, FCaBP, Tc-28, Tc-40, FL-160, CEA, CRP, TcP2ßN- C29 y SA85-1.1. 4. Una fase sólida que tiene inmovilizados sobre ella los cuatro polipéptidos recombinantes FP3 [ID SECUENCIA NO: 1], FP6 [ID SECUENCIA NO: 2], FP10 [ID SECUENCIA NO: 3] y TcF [ID SECUENCIA NO: 4], y un primer control y un segundo control, donde o bien el primer control o bien el segundo control están inmovilizados sobre la fase sólida a una concentración que es menor que la del otro control. 5. La fase sólida de la reivindicación 4, que tiene inmovilizados adicionalmente sobre ella al menos un polipéptido recombinante adicional seleccionado del grupo que consiste en JL8, TCR27, JL7, TCR39, PEP-2, Ag36, JL9, TCNA, TcLo1.2, TS, TcD, TcE, FCaBP, Tc-28, Tc-40, FL-160, CEA, CRP, TcP2ßN-C29 y SA85-1.1. 6. La fase sólida de la reivindicación 4, donde dicha fase sólida se selecciona del grupo que consiste en nitrocelulosa, nailon, plástico y papel. 7. La fase sólida de la reivindicación 4, donde dicha fase sólida es una tira que tiene dichos polipéptidos inmovilizados sobre ella. 8. La fase sólida de la reivindicación 4, donde dichos polipéptidos están dispuestos en forma de bandas separadas sobre dicha fase sólida. 9. Un método para diagnosticar Trypanosoma cruzi en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto una muestra de ensayo obtenida de un sujeto con una fase sólida, donde dicha fase sólida tiene inmovilizados sobre ella los cuatro polipéptidos recombinantes FP3 [ID SECUENCIA NO: 1], FP6 [ID SECUENCIA NO: 2], FP10 [ID SECUENCIA NO: 3] y TcF [ID SECUENCIA NO: 4] en forma de bandas de ensayo separadas, y un primer control y un segundo control, donde adicionalmente o bien el primer control o bien el segundo control están inmovilizados sobre la fase sólida a una concentración que es menor que la del otro control con el fin de comprender un control bajo; poner en contacto la fase sólida con al menos un reactivo de detección; detectar la unión de los anticuerpos presentes en la muestra de ensayo identificando la presencia de una señal en cada una de las bandas de ensayo; comparar la intensidad de cualquier señal identificada en una banda de ensayo para un polipéptido recombinante con la intensidad de la señal del control bajo; donde la identificación de una señal en al menos dos bandas de ensayo de los polipéptidos recombinantes indica la presencia de T. cruzi en dicha muestra de ensayo, siempre que al menos una de las señales identificadas en una banda de ensayo para un polipéptido recombinante tenga una intensidad comparable a la del control bajo. 10. El método de la reivindicación 9, donde la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal y orina. 11. El método de la reivindicación 9, donde dicha fase sólida se selecciona del grupo que consiste en nitrocelulosa, nailon, plástico y papel. 12. El método de la reivindicación 9, donde la fase sólida que tiene adicionalmente inmovilizados sobre ella al menos un polipéptido recombinante adicional seleccionado del grupo que consiste en JL8, TCR27, JL7, TCR39, PEP-2, 31   Ag36, JL9, TCNA, TcLo1.2, TS, TcD, TcE, FCaBP, Tc-28, Tc-40, FL-160, CEA, CRP, TcP2ßN-C29 y SA85-1.1. 13. El método de la reivindicación 9, donde dicha fase sólida es una tira que tiene dichos polipéptidos inmovilizados sobre ella. 32   33   34