Método para determinar o predecir la respuesta de un individuo a una terapia contra el cáncer mediante la evaluación de una respuesta de dicho individuo a la administración de un agente terapéutico biológico o quimioterapéutico consistente en inhibidores de la tirosina-quinasa,

que comprende:

a) detectar la cantidad de uno o más marcadores biológicos en una primera muestra celular o tisular del individuo antes de exponerle al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico, y en una segunda muestra celular o tisular del individuo después de exponerle al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico;

b) comparar la cantidad de uno o más marcadores biológicos en dichas primera y segunda muestras celulares o tisulares;

c) determinar si la expresión o activación del marcador o de los marcadores biológicos disminuye después de la exposición al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico cuando la cantidad del marcador o de los marcadores biológicos en la segunda muestra de tejido es menor que la cantidad del marcador o de los marcadores biológicos en la primera muestra de tejido;

valorándose la respuesta del individuo a la administración de un agente terapéutico biológico o quimioterapéutico y siendo dichos marcadores biológicos c-kit, SCF, pAKT o pc-kit.

Método y ensayo de cuantificación para determinar el estado c-kit/scf/pakt

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a métodos para determinar o predecir la respuesta de un individuo a una terapia contra el cáncer. La invención también se refiere a métodos para utilizar análisis de imágenes de biopsias tisulares mediante tinción inmunohistoquímica con el fin de cuantificar la expresión y activación de c-kit/SCF/pAKT y para identificar compuestos anticancerosos eficaces.

Antecedentes de la Invención

Un objetivo principal de la terapia contra el cáncer es matar selectivamente las células malignas o inhibir su crecimiento incontrolado sin que ello afecte negativamente a las células normales. Los medicamentos quimioterapéuticos tradicionales son agentes altamente citotóxicos que preferentemente tienen mayor afinidad por las células malignas que por las células normales o que al menos afectan preferentemente a las células malignas en base a su alto índice de crecimiento celular y a su actividad metabólica. Sin embargo, con frecuencia estos agentes dañan a las células normales.

Generalmente se utilizan los medicamentos anticancerosos, anticuerpos monoclonales, agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos para provocar la detención del crecimiento, la diferenciación terminal y la muerte de las células cancerosas o precancerosas (Mendelsohn, 1990, Semin. Cancer Biol. 1:339-44; Hancock y col., 1991, Cancer Res. 51:4575-80; Arteaga y col., 1994, Cancer Res., 54:3758-65; Pietras y col., 1994, Oncogene 9:1829-38; Bacus y col., 1997, Anal. Quant. Cytol. Histol. 19:316-28; Bacus y col., 1999, Breast J.; Baselga y col., 1999, Proceedings of AACR NCI EORTC International Conference, Abstract 98; Cobleigh y col., 1999, J. Clin. Oncol.17:2639-48; DiGiovanna, 1999, PPO Updates: Princ. Practice Oncol. 13:1-9; Hortobagyi, 1999, J. Clin. Oncol. 17:25-29; Shak, 1999, Semin. Oncol. 26:71-77; Sliwkowski y col., 1999, Semin. Oncol. 26:60-70; Vincent y col., 2000, Cancer Chemother. Pharmacol. 45: 231-38) . La detención del crecimiento o la muerte celular inducida por fármacos se caracteriza por cambios morfológicos y bioquímicos asociados a la muerte celular programada o a la diferenciación terminal (a diferencia de la muerte celular mitótica) .

Aunque los medicamentos quimioterapéuticos se pueden administrar en dosis suficientemente altas como para provocar la muerte celular, típicamente estas dosis producen efectos nocivos tanto en las células normales como en las células tumorales. Los agentes diferenciadores y el uso de dosis menores de fármacos y de agentes quimioterapéuticos con frecuencia conducen a la detención del crecimiento más que a la muerte celular. Esta detención del crecimiento puede ir seguida de una apoptosis o muerte celular, o la proliferación puede continuar una vez retirados los fármacos quimioterapéuticos. La administración de fármacos citotóxicos y quimioterapéuticos o de radiación ionizante también puede inducir una detención transitoria del crecimiento, estado que depende en gran medida de la función de los inhibidores regulador por p53 y p53 dependiente de la quinasa-ciclina (como p16, p27 y p19) o de inhibidores del crecimiento (como TGF-1, IL-4 e IL-6) . Una vez retirado el fármaco quimioterapéutico, las células sometidas al tratamiento con el fármaco finalmente reanudarán su división y seguirán proliferando o morirán. Algunas células tumorales tratadas con fármacos experimentan una detención prolongada del crecimiento y no consiguen reanudar la división celular una vez libres del fármaco.

Generalmente se considera la apoptosis como una respuesta suicida activa ante diversos estímulos fisiológicos o patológicos. Estudios recientes han demostrado que diversos agentes perjudiciales para el ADN, incluyendo la irradiación con rayos X, y varios fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo agentes de alquilación e inhibidores de la topoisomerasa II) inician las vías que conducen a la apoptosis. Todavía no se conoce el mecanismo exacto por el cual estos agentes inducen la apoptosis. Sin embargo, está implicada la expresión del gen supresor tumoral p53 en este proceso (Kwok y Sutherland, 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81:1020-24; Kwok y Sutherland, 1991, Int. J. Cancer 49:73-76; Lane, 1992, Nature 358:15-16; Kuerbitz y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7491-95; Luo y col., 1995, Nature 375:159-61; Liu y col., 1996, Cancer Res. 56:31-35; Mellinghoff y Sawyers, 2000, PPO Updates 14:1-11) . Además, la sobre-regulación de las caspasas (por ejemplo caspasa 9 o caspasa 3) o de sus moléculas chaperones (por ejemplo proteína de choque térmico 60) también se ha asociado a la apoptosis.

Las células se pueden hacer resistentes a la apoptosis de diversas maneras, incluyendo la deleción de genes celulares tales como el antioncogén PTEN, la sobreexpresión de Ras activo y la sobreexpresión de PI3K activo. Se ha identificado una proteína celular en particular, la AKT (el producto proteínico del gen c-akt) , como un regulador clave de la supervivencia celular e inhibidor de la apoptosis que tiene implicaciones significativas en la oncogénesis y la resistencia a los fármacos. Por ejemplo, la pérdida de PTEN está correlacionada con un aumento de la actividad de AKT (Li y col., 1997, Science 275:1943-47; Liaw y col., 1997, Nat. Genet. 16: 64-67; Nelen y col., 1997, Hum. Mol. Genet. 6:1383-87; Cantley y Neel, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4240-45; Datta y col., 1999, Genes Dev. 13:2905-27) . Además, la supresión de la apoptosis no es la única función que la AKT puede tener en la estimulación de la oncogénesis. En algunos casos, la AKT también puede inducir la progresión del ciclo celular. Sin embargo, la observación de que la AKT puede suprimir la apoptosis sugiere que los oncogenes pueden bloquear la apoptosis celular adaptativa mediante una hiperactivación de la AKT.

Dada la complejidad de los mecanismos apoptóticos, existen diversas vías por las que la AKT puede promover la supervivencia celular e inhibir la muerte celular. La AKT puede bloquear la apoptosis regulando la expresión o la actividad de miembros de la familia de genes Bcl-2 (conocida por desempeñar un papel en la supervivencia o la muerte celular) . Alternativamente, la AKT puede regular la expresión o la actividad de la familia de proteínas de la caspasa o la función de vías receptoras de muerte celular. El efecto regulador de la AKT se puede producir a través de un mecanismo directo -por ejemplo la fosforilación de componentes del mecanismo apoptótico -o de un mecanismo indirecto, tal como la alteración del nivel de expresión de genes que codifican componentes del mecanismo de muerte celular. Recientes estudios sugieren que la AKT regula la apoptosis en múltiples lugares. Se han identificado diversas dianas AKT, todas ellas desempeñando papeles críticos en la mediación de la muerte celular, incluyendo BAD, caspasa9, la familia Forkhead de factores de transcripción y el IKK regulador de NFKB (Datta y col., 1999, supra) .

El proto-oncogén c-kit codifica un receptor del factor de crecimiento transmembrana de la tirosina-quinasa, que se encuentra en la misma clase que los receptores de PDGF y CSF-1 en virtud de sus dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina y de las interrupciones de su dominio citoplásmico de tirosina-quinasa por una inserción hidrofílica (Yarden y col., 1987, EMBO J. 6:3341-3351) . Su ligando, conocido alternativamente como factor de crecimiento de células madre (stem cell growth factor -“SCF”) , factor de crecimiento de mastocitos, ligando kit o factor steel, es un factor de crecimiento hematopoyético precoz que, junto con otros factores de crecimiento, apoya la proliferación y diferenciación de múltiples linajes hematopoyéticos. Id En diversas líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas y líneas celulares de cáncer de mama se ha demostrado que se produce una coexpresión de c-kit y SCF, lo que sugiere que la estimulación del crecimiento autocrino puede jugar un papel en tumores no hematopoyéticos. El crecimiento autocrino requiere la coexpresión de SCF y c-kit. En dos estudios independientes, la inmunotinción de secciones congeladas utilizando antisueros policlonales dirigidos contra el terminal carboxilo de c-kit ha demostrado la tinción de intensidad uniforme de las células epiteliales ductales de mama normales. Estos estudios también han demostrado que, utilizando la misma metodología, al menos un 10-20% de los carcinomas de mama retienen la expresión de c-kit. Sin embargo, ninguno de estos estudios se ha dirigido a la expresión... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar o predecir la respuesta de un individuo a una terapia contra el cáncer mediante la evaluación de una respuesta de dicho individuo a la administración de un agente terapéutico biológico o quimioterapéutico consistente en inhibidores de la tirosina-quinasa, que comprende:

a) detectar la cantidad de uno o más marcadores biológicos en una primera muestra celular o tisular del individuo antes de exponerle al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico, y en una segunda muestra celular o tisular del individuo después de exponerle al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico;

b) comparar la cantidad de uno o más marcadores biológicos en dichas primera y segunda muestras celulares o tisulares;

c) determinar si la expresión o activación del marcador o de los marcadores biológicos disminuye después de la exposición al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico cuando la cantidad del marcador o de los marcadores biológicos en la segunda muestra de tejido es menor que la cantidad del marcador o de los marcadores biológicos en la primera muestra de tejido;

valorándose la respuesta del individuo a la administración de un agente terapéutico biológico o quimioterapéutico y siendo dichos marcadores biológicos c-kit, SCF, pAKT o pc-kit.

2. Método para determinar o predecir la respuesta de un individuo a una terapia contra el cáncer mediante la predicción de la respuesta de dicho individuo a la administración de un agente terapéutico biológico o quimioterapéutico consistente en inhibidores de la tirosina-quinasa, que comprende:

a) detectar la cantidad de uno o más marcadores biológicos en una muestra celular o tisular del individuo antes de exponerle al agente terapéutico biológico o quimioterapéutico;

b) comparar la cantidad de uno o más marcadores biológicos detectados en a) con la cantidad de una o más muestras que expresan cantidades conocidas de los marcadores; y c) determinar el nivel de expresión o la activación del marcador o de los marcadores biológicos en comparación con el nivel de expresión o de activación de las muestras de control;

prediciéndose la respuesta de un individuo a la administración de un agente terapéutico biológico o quimioterapéutico en base a la determinación de la disminución del nivel de expresión o de activación del marcador o de los marcadores biológicos, y siendo dichos marcadores biológicos c-kit, SCF, pAKT o pc-kit.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el método para detectar la cantidad de dicho o dichos marcadores biológicos incluye la utilización de uno o más anticuerpos que son inmunológicamente específicos para dicho o dichos marcadores biológicos.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la cantidad de dicho o dichos marcadores biológicos se determina de forma inmunohistoquímica.

5. Método según la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque el método para detectar la cantidad de dicho o dichos marcadores biológicos comprende:

a) teñir la primera y la segunda muestra celular o tisular tal como se ha definido en la reivindicación 1 o teñir las muestras celulares o tisulares tal como se ha definido en la reivindicación 2 utilizando uno o más anticuerpos marcados de forma detectable con un marcador de densidad óptica, siendo al menos un anticuerpo inmunológicamente específico para uno o varios marcadores biológicos y siendo los marcadores biológicos ckit, SCF, pAKT o pc-kit; y b) determinar la densidad óptica de la primera y la segunda muestra de tejido teñida en a) ;

correspondiendo dicha densidad óptica a la cantidad de dicho o dichos marcadores biológicos.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque la densidad óptica se determina mediante análisis de imágenes.

7. Método según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque el marcador detectable es un cromógeno o un fluoróforo.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque el marcador detectable es DAB.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el agente quimioterapéutico o el agente terapéutico biológico es GlivacTM.

Inmunohistoquímica para C-KIT y su ligando, SCGF, en la muestra 12669b9

Figura 1A

Inmunohistoquímica para C-KIT y su ligando, SCGF, en la muestra 12669b9

Figura 1B

Inmunohistoquímica para C-KIT y su ligando, SCGF, en la muestra 12669b9

Figura 1C

Inmunohistoquímica para C-KIT y su ligando, SCGF, en la muestra 12669b9

Figura 1D

Figura 2A

Cáncer de MamaFigura 2B

Cáncer de MamaFigura 2C

Cáncer de VejigaFigura 2D

Cáncer de VejigaFigura 2E

Niveles de c-kit, SCF y pAKT en 5 muestras tumorales diferentes

747 Mama 848 Mama 864 Mama 895 Mama 920 Vejiga Figura 3

Actividad de c-Kit en células de cáncer de mama tratadas con ligando SCF y/o inhibidor STI. El c-Kit se inmunoprecipitó a partir de lisados celulares MDA-MB-361 (50 μg proteína total) , se sometió a western blot y se sometió a screening con anticuerpos antifosfotirosina para detectar el receptor de c-Kit activo. Como se esperaba, el receptor de c-Kit se activaba mediante el tratamiento con SCF, pero se inhibía con tan solo 1 μM STI-571.

Figura 4

Western Blot de c-Kit en células HeLa. Anticuerpos policlonales de conejo contra c-Kit humana de NeoMarkers (dilución 1:200) y DAKO (dilución 1:400) , detectados con anticuerpos conjugados con HPR contra IgG de conejo (Amersham) y sustrato quimioluminiscente (NEN) .

Figura 5