Método y composiciones para identificar y caracterizar la Hepatitis C.

Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende una secuenciaseleccionada del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 3;

b) un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 en donde el ácidonucleico es capaz de asociarse al gen NS4 del HCV o una de sus porciones;

c) un fragmento de al menos 8 nucleótidos de un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidosde SEC ID NO: 3; y

d) un ácido nucleico que es al menos 80% idéntico a una secuencia de nucleótidos como se ha definidoen uno cualquiera de (a) a (c),

Método y composiciones para identificar y caracterizar la hepatitis C

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº de serie 60/363.603 presentada el 11 de marzo de 2002.

Fundamento de la invención

El virus de la hepatitis C (en lo sucesivo abreviadamente HCV, por sus iniciales en inglés) es el principal agente etiológico para la hepatitis no-A, no-B. Se estima que están infectadas alrededor de 400 millones de personas o más del 2% de la población mundial (Di Bisceglie, A. M. (1998) , Hepatitis C. Lancet 351: 351-5; Houghton M. (1996) , pp. 1035-1058. En B. N. Fields y D. M. Knipe y H. P. M. (ed.) , Fields' Virology, 3ª ed. Lippincott-Raven, Philadelphia/New York) . La enfermedad por HCV habitualmente es el resultado de una infección crónica en el 60 a 80% de los individuos infectados, de los cuales el 20% progresa a cirrosis, carcinoma hepatocelular o insuficiencia hepática crónica. En todo el mundo se han identificado al menos 6 genotipos virales principales y se han propuesto más de 50 subtipos de HCV (Simmonds, P. et al., (1994) Identification of genotypes of hepatitis C virus by sequence comparisons in the core, E1 and NS-5 regions. J. Gen. Virol. 75: 1053-1061) . Estos genotipos están basados en una diversidad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, difiriendo los aislados más divergentes en más del 30% (Bréchot, C. et al., (1996) Hepatitis C virus: Molecular biology and genetic variability. Digestive Diseases and Sciences 41: 6S-21S; Bukh, J. et al., (1995) Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Semin. Liver Dis. 15: 41-63) . Entre los diferentes tipos, hay regiones que están altamente conservadas y tienen una homología de secuencias próxima al 100%, sin embargo, en las regiones altamente variables, tales como las proteínas de la envolvente es <70% (Booth, J. C. et al., (1998) Comparison of the rate of sequence variation in the hypervariable region of E2/NS1 region of hepatitis C virus in normal and hypogammaglobulinemics patients. Hepatology 27: 223-27; Hayashi, N. et al., (1993) Molecular cloning and heterogeneity of the human hepatitis C virus (HCV) genome. J. Hepatol. 17: S94-107; Hijikata, M. et al., (1991) Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 220-228; Kato, N. (1992) Marked sequence diversity in the putative envelope protein of hepatitis C viruses. Virus Res. 22: 107-123; Lesniewski, R. R. et al., (1993) Hypervariable 5'-terminus of hepatitis C virus E2/NS1 encodes antigenically distinct variants. J. Med. Virol. 40: 150156; Pozzetto, B. et al., (1996) Structure, genomic organization, replication and variability of hepatitis C virus. Nephrol. Dial. Transplant. 11 [Suppl 4]: 2-5; Vizmanos, J. L. et al., (1998) , Degree and distribution of variability in the 5'-untranslated, E1, E2/NS1 and NS5 regions of the hepatitis C virus (HCV) . J. Viral Hepat. 5: 227-240) .

El HCV es un miembro de la familia Flaviviridae cuyos otros miembros incluyen Flavivirus y Pestivirus (Kato, N. et al., (1991) Molecular structure of the Japanese hepatitis C viral genome. FEBS Lett. 280: 325-328) . El genoma del HCV es RNA de cadena positiva de de aproximadamente 9, 5 kb que contiene un único marco de lectura abierto que codifica una poliproteína de 3010 a 3033 aminoácidos (Takamizawa, A. et al., (1991) Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J. Virol. 65: 1105-1113) . El procesamiento proteolítico de la poliproteína se realiza por proteasas del hospedante y virales. Las peptidasas del hospedante escinden las proteínas estructurales que están localizadas en el extremo 5', mientras que las proteasas virales escinden las proteínas no estructurales. Estas escisiones dan como resultado al menos 10 proteínas virales en el orden NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. También existen regiones no codificadoras localizadas en los extremos 5' y 3' que están implicadas en la unión al ribosoma y en la iniciación de la replicación, respectivamente.

Una de las proteasas virales, la proteasa NS3, está codificada por la región N-terminal del gen NS3 del HCV. Consiste en 181 aminoácidos y es una serina-proteasa similar a quimotripsina responsable de la escisión de las proteínas no estructurales del HCV (Bartenschlager, R. et al., (1993) Nonstructural protein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type protease required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. J. Virol. 67: 3835-3844; Eckart, M. R. et al., (1993) . The hepatitis C virus encodes a serine protease involved in processing of the putative nonstructural proteins from the viral polyprotein precursor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 399-406; Gallinari,

P. et al., (1998) Multiple enzymatic activities associated with recombinant NS3 protein of hepatitis C virus. J. Virol. 72: 6758-6769; Hahm, B. et al., (1995) NS3-4A of hepatitis C virus is a chymotr y psin-like protease. J. Virol. 69: 25342539; Hijikata, M. et al., (1993) Two distinct proteinase activities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis C virus. J. Virol. 67: 4665-4675; Hijikata, M. et al., (1993) Proteolytic processing and membrane association of putative nonstructural proteins of hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 10773-10777; Manabe, S. et al., (1994) Production of nonstructural proteins of hepatitis C virus requires a putative viral protease encoded by NS3. Virology 198: 636-644; Tomei, L. et al., (1993) NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein. J. Virol. 67: 4017-4026) . El procesamiento de las proteínas estructurales por NS3 ocurre en una cascada bien ordenada ocurriendo la primera escisión entre NS3 y NS4A seguida por NS5A-NS5B, NS4A-NS4B y NS4B-NS5A (Bartenschlager, R. et al., (1994) Kinetic and structural analysis of hepatitis C virus polyprotein processing. J. Virol. 68: 5045-5055; D'Souza, E. D. et al., (1994) Analysis of NS3-mediated processing of the hepatitis C virus non-structural region in vitro. J. Gen. Virol. 75: 3469-3476; Eckart

M. R. et al., 1993, supra; Failla, C. et al., (1994) Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural proteins. J. Virol. 68: 3753-3760; Kolykhalov, A. A. et al., (1994) Specificity of the hepatitis C virus NS3 serine protease: effects of substitutions at the 3/4A, 4A/4B, 4B/5A, and 5A/5B cleavage sites on polyprotein processing. J. Virol. 68: 7525-7533; Shimotohno, K. et al., (1995) Processing of the hepatitis C virus precursor protein. J. Hepatol. 22: 87-92; Shoji, I. et al., 1999 Internal processing of hepatitis C virus NS3 protein. Virology 254: 315-323; Tomei, L. et al., 1993, supra) . La escisión entre NS3 y NS4A ocurre en cis, mientras que las otras escisiones son en trans. El co-factor codificado por el virus, NS4A, es necesario para la función eficaz de NS3. La eficacia del procesamiento proteolítico se ha demostrado que aumenta espectacularmente en presencia de la proteína NS4A (Failla, C. et al., (1995) An amino-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 proteinase is essential for the interaction with NS4A. J. Virol. 69: 1769-1777; Failla, 1994, supra; Gallinari, P. et al., 1999 Modulation of hepatitis C virus NS3 protease and helicase activities through the interaction with NS4A. Biochemistr y 38: 5620-5632; Lin, C. et al., (1995) A central region in the hepatitis C virus NS4A protein allows formation of an active NS3-NS4A serine protease complex in vivo and in vitro. J. Virol. 69: 4373-4380; Satoh, S. et al., (1995) The N-terminal region of hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3) is essential for stable complex formation with NS4A. J. Virol. 69: 42554260; Tanji, Y. et al., (1995) Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing. J. Virol. 69: 1575-1581) . Además, NS3 contiene un átomo de zinc unido tetraédricamente, que parece desempeñar una función estructural (De Francesco, R. et al., (1996) A zinc binding site in viral serine proteinases. Biochemistr y 35: 13282-13287; Stempniak, M. et al., (1997) The NS3 proteinase domain of hepatitis C virus is a zinc-containing enzyme. J. Virol. 71: 2881-2886) .

Recientemente se ha logrado un progreso considerable en determinar cómo la proteasa NS3 procesa el polipéptido de HCV (Kolykhalov, A. A. et al., 1994 supra; Steinkühler, C. et al., (1996) Activity of purified hepatitis C virus protease NS3 on peptide substrates. J. Tirol. 70: 6694-6700; Urbani, A. et al., (1997) . Substrate... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 3;

b) un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 en donde el ácido nucleico es capaz de asociarse al gen NS4 del HCV o una de sus porciones;

c) un fragmento de al menos 8 nucleótidos de un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 3; y

d) un ácido nucleico que es al menos 80% idéntico a una secuencia de nucleótidos como se ha definido en uno cualquiera de (a) a (c) ,

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que además comprende un marcador seleccionado del grupo que consiste en un grupo fluorescente, digoxigenina, biotina, marcadores radiactivos, grupos quimioluminiscentes, enzimas, anticuerpos, agentes luminiscentes, agentes precipitantes y colorantes.

3. Un oligonucleótido para amplificar una secuencia ácido nucleico en una muestra, en donde la muestra proviene de un paciente infectado con el HCV y que contiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEC ID NO: 3 o uno de sus complementos.

4. Un kit para la detección del HCV, que comprende un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos, en donde el oligonucleótido comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. El kit de la reivindicación 4, en donde dicho kit comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en: al menos un oligonucleótido marcado para detectar ácido nucleico del HCV amplificado; una pluralidad de nucleótidos, una polimerasa de ácido nucleico, al menos otro componente para realizar una reacción de amplificación por polimerasa e instrucciones para su uso.

6. Un método para amplificar un ácido nucleico diana, comprendiendo el método: combinar un ácido nucleico diana proveniente del genoma del HCV en condiciones que permitan que ocurra una reacción de amplificación con:

a) una o más secuencias de cebador de ácido nucleico que son al menos 80% idénticas a la secuencia descrita como SEC ID NO: 3; b) una polimerasa de ácido nucleico; y c) una pluralidad de nucleótidos, que dan como resultado un ácido nucleico diana amplificado.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico diana es del gen NS3 o NS4 del genoma del HCV.

8. Un método para detectar específicamente ácidos nucleicos de HCV en una muestra que comprende:

a) poner en contacto dicha muestra con una o más secuencias de ácido nucleico que son al menos 80% idénticas a las secuencias descritas como SEC ID NO: 3, en condiciones tales que dichos ácidos nucleicos del HCV pueden hibridarse con dichos cebadores;

b) someter a transcripción inversa y amplificación a dichos ácidos nucleicos para obtener ácidos nucleicos del HCV amplificados; y

c) detectar la presencia de dichos ácidos nucleicos del HCV amplificados.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la detección de la presencia de dichos ácidos nucleicos del HCV amplificados comprende:

a) poner en contacto dichos ácidos nucleicos del HCV amplificados con un oligonucleótido marcado para obtener ácidos nucleicos del HCV marcados; y

b) identificar dichos ácidos nucleicos marcados.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende además la etapa de secuenciar el ácido nucleico amplificado, y opcionalmente la etapa de evaluar la secuencia respecto a mutaciones.

11. Un método in vitro para determinar si un paciente es resistente a un agente, comprendiendo el método:

a) realizar la amplificación por PCR del DNA de una muestra que contiene DNA de un paciente usando una secuencia de cebador de ácido nucleico que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3; y

b) analizar el producto amplificado, determinando con ello si un paciente es resistente a un agente.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el agente es un agente antiviral, un inhibidor de proteasa, un inhibidor de la porción de serina-proteasa del gen NS3, un inhibidor de la porción de helicasa del gen NS3, un alfainterferón, un interferón pegilado o una combinación de agentes.

13. Un método in vitro para determinar si un agente puede ser usado o no puede ser usado para tratar un paciente que tiene infección por HCV, comprendiendo el método las etapas de:

a) amplificar una muestra que contiene un ácido nucleico de un paciente infectado con HCV usando una secuencia de cebador de ácido nucleico que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 y

b) secuenciar las secuencias de ácidos nucleicos del HCV amplificado resultante; y

c) identificar las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico del HCV amplificado que correlacionan la resistencia o la sensibilidad a un agente antiviral, determinando de este modo si un agente puede usarse

o no para tratar un paciente que tiene infección por HCV.

14. Un método in vitro para determinar si un tratamiento con un agente debe ser continuado o no debe ser continuado en un paciente infectado con HCV, comprendiendo el método:

a) realizar el método de la reivindicación 6 sobre dos o más muestras que comprenden DNA de un paciente durante el curso del tratamiento;

b) secuenciar el producto de ácido nucleico diana amplificado resultante de la reivindicación 6;

c) identificar las mutaciones presentes en el producto amplificado que están correlacionadas con la resistencia o la sensibilidad al agente; y

d) continuar el tratamiento cuando las mutaciones identificadas en el producto amplificado no cambian durante el curso del tratamiento o discontinuar el tratamiento cuando las mutaciones identificadas en el producto amplificado cambian durante el curso del tratamiento.

15. Un método in vitro para determinar la eficacia de un agente para tratar el HCV, comprendiendo el método:

a) secuencias de ácido nucleico de una primera muestra de un paciente expuesto a un agente, en donde las secuencias de ácidos nucleico son productos amplificados de una o más secuencias de cebador de ácido nucleico que son al menos 80% idénticas a la secuencia que se describe como la SEC ID NO: 3; y

b) secuencias de ácido nucleico de una segunda muestra de un paciente que no ha sido expuesto a un agente, en donde las secuencias de ácidos nucleicos son productos amplificados de una o más secuencias de cebadores de ácidos nucleicos que son al menos 80% idénticas a la secuencia que se describe como la SEC ID NO: 3;

en donde un número creciente de mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos de la primera muestra, con respecto a la segunda muestra, es una indicación de que el agente no es eficaz para tratar el HCV.