Método de estabilización de un reactivo mediante la inactivación de una primera especie de unión disociada,

que comprende: proporcionar un recipiente de almacenamiento de reactivo que incluye un medio líquido que contiene una primera especie de unión fijada a un primer sustrato; un material permeable que incluye una superficie interna que incluye un segundo sustrato que tiene una afinidad por dicha primera especie de unión; y una superficie externa permeable a la primera especie de unión cuando se disocia de dicho sustrato.

Método y composición para estabilizar reactivos líquidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para estabilizar reactivos líquidos atrapando especies de unión libres en una disolución o suspensión de reactivo. En particular, la presente invención proporciona un método para inmovilizar especies de unión libres en una disolución de reactivo usando un sustrato de unión que tiene selectividad para la unión a la especie de interés.

Antecedentes de la invención

En diagnósticos clínicos in vitro modernos, se usa una variedad de métodos para la detección de analitos en una muestra. En una forma de un método de diagnóstico, un inmunoensayo, se usan una o más especies de unión específica. Ejemplos típicos son el inmunoensayo de tipo sándwich, en el que dos especies de unión específica (anticuerpo o antígeno) se unen al analito de interés, y el inmunoensayo de competición, en el que el analito de interés y un análogo de este analito compiten por la unión a una especie de unión específica. Una de las especies de unión específica se fija comúnmente a un denominado marcador o etiqueta, que puede ser un átomo (por ejemplo, radioactivo) , molécula (por ejemplo, un compuesto enzimático, fluorescente o luminiscente) o partícula (magnética o látex) . Este marcador permite la detección del analito de interés mediante una variedad de métodos de detección correspondientes al marcador usado. En un ensayo de competición, o bien la especie de unión específica o bien el análogo de analito pueden llevar el marcador.

La otra especie de unión específica está con frecuencia asociada a un sustrato sólido o que puede ponerse en suspensión ("la fase sólida") de manera covalente o mediante adsorción. Alternativamente, puede conectarse a un primer miembro de una segunda pareja de unión (por ejemplo, biotina) , mientras que el segundo miembro de la segunda pareja de unión (por ejemplo, estreptavidina) se fija a la fase sólida. Esto permite que la especie de unión específica se una a la fase sólida mediante la interacción de la segunda pareja de unión (por ejemplo, biotinaestreptavidina) .

Las fases sólidas pueden ser fases sólidas macroscópicas, tales como pocillo de microtitulación, dispositivos de tubo y bola en tubo, o fases sólidas que pueden ponerse en suspensión, tales como perlas, perlas de látex, perlas de látex magnéticas, así como otros materiales paramagnéticos. Habitualmente se marca una especie de unión secundaria mediante el uso de una etiqueta. La interacción entre la etiqueta y la fase sólida permite la detección y cuantificación del analito de interés mediante una variedad de métodos de detección correspondientes al marcador usado.

Es importante para la estabilidad y reproducibilidad del ensayo de diagnóstico que la capacidad de unión de la especie unida a la fase sólida por su pareja de unión no resulte afectada a lo largo del tiempo. Esto puede dar como resultado una disminución de la capacidad de reacción y disminución de la sensibilidad del ensayo. Un mecanismo que puede conducir a una alteración de este tipo (aparente como inestabilidad) es el escape de una parte de la especie fijada a la fase sólida al medio circundante. La especie libre compite con la especie fijada a la fase sólida por la unión a la diana y habitualmente tiene una ventaja cinética significativa debido a su difusión más rápida. Por tanto, resulta ventajoso mantener constante la cantidad de especie libre que compite con la especie fijada a la fase sólida en un reactivo, preferiblemente muy próxima a cero. Esto permitirá la detección sensible de analitos de una manera estable y reproducible. La manera preferida de eliminar especies libres es hallar un método de unión que elimine la disociación. La unión covalente, al contrario que la asociación por adsorción, puede ser el método de elección, debido a su mayor fuerza de unión. Sin embargo, en muchos casos esto puede ser imposible o no ser práctico por diversos motivos.

Por ejemplo, el material elegido para la fase sólida puede carecer de grupos activos adecuados para el acoplamiento covalente. Si es el caso, debido al tipo de ensayo, o por consideraciones de coste, entonces la adsorción será la elección preferida de asociación. Un método alternativo implica tener una especie de unión que está fijada al material de fase sólida indirectamente mediante una especie de unión auxiliar. Un ejemplo de esto sería un antígeno o anticuerpo biotinilado que se fija a un sustrato recubierto con avidina, siendo la avidina la especie auxiliar. La propia especie de unión auxiliar puede estar asociada con la fase sólida mediante un enlace covalente o mediante adsorción. Este método puede usarse cuando la especie de unión se inactiva si se asocia directamente con el material de fase sólida. De nuevo, dado que la constante de afinidad de la especie de unión auxiliar no es infinita, puede producirse algo de disociación, en forma de escape.

Un método adicional incluye especies de unión que consisten en subunidades que o bien están asociadas de manera no covalente entre sí o bien tienen un enlace covalente que es reversible en condiciones de almacenamiento normales. Las subunidades que están fijadas de esta manera reversible e indirectamente a la fase sólida pueden disociarse de la (s) subunidad (es) acoplada (s) a la superficie. Si la subunidad libre conserva su capacidad de unión en el ensayo, o la recupera tras combinarse con otras subunidades libres, la subunidad libre puede interferir en el ensayo.

Si no puede eliminarse el escape, se han empleado varias prácticas, cada una con sus desventajas particulares, para compensar el escape, incluyendo las siguientes:

1) Recalibración frecuente para corregir la desviación provocada por el escape de la especie de unión. La desventaja más obvia es el coste adicional por el reactivo y el tiempo empleados en la recalibración. El escape también puede limitar la vida útil de almacenamiento debido a que las señales de ensayo disminuyen hasta niveles insuficientes.

2) Suministrar los inmunoensayos y otros reactivos de ensayo de diagnóstico en una forma seca, tal como producto liofilizado o secado al aire. Este enfoque elimina habitualmente el escape, pero normalmente se necesita reconstituir los reactivos secos mediante adición de líquido, lo que requiere tiempo y esfuerzo por parte de un usuario. El propio procedimiento de secado requiere procesamiento adicional por parte del fabricante e introduce una fuente de falta de homogeneidad y variación entre botellas no encontrada en reactivos en una forma líquida. El procedimiento de secado también puede aumentar la variación entre lotes.

3) Si la fase sólida es estacionaria (por ejemplo placa de microtitulación) o puede separarse convenientemente del líquido (perlas magnéticas u otras perlas de mayor o menor tamaño) , es posible "lavar" el reactivo con agua o un líquido apropiado antes de comenzar el ensayo. Una desventaja de este enfoque implica el tiempo, esfuerzo y materiales adicionales requeridos para una etapa de "lavado previo" y los límites impuestos sobre la flexibilidad en el diseño de la secuencia de ensayo.

La patente estadounidense número 5.212.063 da a conocer una trampa de ligando útil para reducir o eliminar la interferencia de biotina en inmunoensayos que emplean anticuerpos marcados con biotina (u otra especie biotinilada) . La biotina, que se produce de manera natural en fluidos corporales, puede competir con la especie biotinilada por sitios de unión en el conjugado de avidina o estreptavidina empleado en estos ensayos y provocar resultados erróneos. La biotina se elimina selectivamente de la reacción inmunológica incubando la disolución de muestra con partículas poliméricas consistentes en un núcleo modificado con estreptavidina y un recubrimiento biopolimérico.

La patente estadounidense número 5.863.740 da a conocer un agente de eliminación de interferencias mediante la modificación e inactivación de moléculas de estreptavidina mediante saturación con biotina, modificación química o ingeniería genética.

La patente estadounidense número 4.256.834 da a conocer un inmunoensayo de partículas eliminadoras fluorescentes. Un reactivo empleado en la reacción contiene un represor de señales. Este represor de señales interacciona con un marcador conectado a un elemento de un sistema de producción de señales en disolución a granel. Tras acoplar el marcador y el elemento del sistema de producción de señales al elemento homólogo... [Seguir leyendo]

1. Método de estabilización de un reactivo mediante la inactivación de una primera especie de unión disociada, que comprende: proporcionar un recipiente de almacenamiento de reactivo que incluye un medio líquido que contiene una primera especie de unión fijada a un primer sustrato; un material permeable que incluye una superficie interna que incluye un segundo sustrato que tiene una afinidad por dicha primera especie de unión; y una superficie externa permeable a la primera especie de unión cuando se disocia de dicho sustrato.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la primera especie de unión está fijada a una superficie de unión definida en el primer sustrato, y las regiones de unión en el segundo sustrato están formadas sobre una superficie de unión definida en el segundo sustrato, y en el que la superficie de unión definida en el primer sustrato y la superficie de unión definida en el segundo sustrato están formadas por los mismos materiales.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la primera especie de unión se selecciona del grupo que consiste en biotina, avidina, estreptavidina, un antígeno, un anticuerpo, un hapteno, un receptor y un oligonucleótido.