MÉTODO Y APARATO DE EMPOTRAMIENTO RÁPIDO DE BLOQUES CON CÉLULAS.

Método y aparato de empotramiento rápido de bloques con células CAMPO DEL INVENTO El presente invento se refiere a dispositivos para preparar células para su examen microscópico y para conseguir las células para ensayos moleculares e inmunológicos. Más particularmente, el invento se refiere a un aparato para empotrar células y fragmentos de tejido dentro de un sustrato sólido, tal como parafina, para permitir su corte con un microtomo para evaluación microscópica, y para su almacenaje en estado estable. ANTECEDENTES Muchos procesos de enfermedad solamente pueden diagnosticarse sobre la base de exámenes histológicos o citológicos utilizando un microscopio óptico. Por ejemplo, si bien la presencia de un tumor puede detectarse utilizando dispositivos radiológicos, la determinación de si un tumor es benigno o maligno exige la interpretación de un patólogo acerca del aspecto de las células utilizando microscopía óptica. Sin embargo, antes de llegar a esta etapa, prime- ro debe recuperarse, recogerse y tratarse la muestra de tejido para el examen microscópico. Hay varias técnicas disponibles para recuperar y recoger biopsias o muestras celulares de un paciente. Resulta beneficioso para los pacientes el empleo de técnicas minimamente invasivas para la obtención de muestras celulares o biopsias. Por ejemplo, pueden obtenerse pequeños fragmentos de tejido mediante una biopsia por aspiración con una aguja fina o raspando superficies de una cavidad del cuerpo accesible mediante técnicas endoscópicas minimamente invasivas. Una vez recuperadas, las células han de ser tratadas luego para prepararlas para microscopia. Se conocen una va- riedad de técnicas de tratamiento, incluyendo la técnica Cytospin y la técnica Thin-Prep para depositar fragmentos de tejido directamente sobre el portaobjetos de un microscopio. El documento JP-A-2000-146782 describe formas de gestionar una presión de aspiración cuando se crean especímenes citológicos en un filtro en una técnica tal como la técnica ThinPrep. Otra técnica, comúnmente denominada preparación de bloques con células, ofrece varias ventajas con respecto al depósito directo de fragmentos de tejido. El procedimiento de preparación de bloques con células inmoviliza las células o los pequeños fragmentos de tejido en un soporte sólido, típicamente cera de parafina. Uno de tales procedimientos de preparación de bloques con células se describe en el documento US-A-5817032. Se cortan entonces secciones delgadas del bloque con células con un microtomo y las secciones se montan en un portaobjetos de un microscopio con el fin de someterlas a examen. Las secciones resultantes del bloque con células presentan la información diagnóstica en una forma que complementa las técnicas de depósito directo. Por ejemplo, las disposiciones arquitectónicas de las células unas con respecto a otras se presentan mejor en sección a partir de un bloque con células que en el caso de células depositadas directamente en el portaobjetos de un microscopio. Los bloques de células también permiten llevar a cabo importantes ensayos de diagnóstico inmunológicos y moleculares sobre las muestras de células, los cuales no resultaría práctico realizar o serían difíciles de llevar a cabo sobre preparaciones directas. Además, parece que los bloques de células preservan las células en forma conveniente a temperatura ambiente por tiempo indefinido, facilitando por tanto la investigación biomédica. El método de preparación de bloques con células requiere que los fragmentos de células se "empotren" en un medio sólido, más comúnmente cera de parafina. El "empotramiento" requiere los siguientes pasos genéricos: (1) de las células hay que eliminar todas las moléculas de agua, típicamente con alcohol (el agua es miscible con el alcohol); (2) luego, debe eliminarse todo el alcohol, así como todas las sustancias grasas y reemplazarlos, típicamente, por xileno (el xileno es miscible con el alcohol pero no con el agua); (3) debe eliminarse el xileno y reemplazarlo con cera (la cera es miscible con el xileno pero no con la mayoría de alcoholes ni con el agua); y (4) las células en cera fundida deben organizarse entonces manualmente y endurecerse en el lado inferior de una casete para tejido, de manera que pueda cortarse una sección del bloque de cera con el tejido empotrado utilizando un microtomo. Los primeros tres de estos pasos se ejecutan, comúnmente mediante un "dispositivo de tratamiento de tejido", que es una máquina que hace circular alcohol, xileno y cera fundida, en secuencia, en una cámara que contiene la casete para tejido. Las casetes de tejido cumplen, típicamente, el doble propósito de contener la muestra de células durante el proceso de empotramiento y de proporcionar un mecanismo de unión para mantener el bloque de cera en la máquina del microtomo de modo que la muestra de células subsiguientemente empotrada en cera en la superficie inferior de la casete, pueda ser cortada en secciones delgadas. Antes de que pueda tener lugar el "empotramiento", la muestra de células debe ser manipulada para concentrar las células y facilitar su transferencia en todo el proceso de empotramiento. Un procedimiento comúnmente seguido para preparar tales bloques de células, es la técnica de coagulación, descrita por Yang y otros en Acta Cytologica, 42: 703-706 (1998). La técnica de coagulación supone los siguientes pasos genéricos: (1) se centrifuga una muestra de células durante 10 minutos; (2) el sobrenadante se vierte manualmente dejando un botón de células concentradas; (3) se añaden manualmente fibrina y trombina, obtenidas de suministros de un banco de sangre, al botón de células y se realiza una incubación durante 15 minutos con agitación manual ocasional para atrapar el botón de célu- 2 E03768547 27-10-2011   las en la fibrina coagulante; (4) la muestra de células coagulada se retira manualmente con cuidado del tubo de centrifugado para evitar perder células debido al estriado del coágulo a lo largo del costado del tubo o la rotura del coágulo en piezas pequeñas no utilizables en la práctica; (5) la muestra de células coagulada es transferida manualmente a un papel para lentes que, luego, es plegado y colocado manualmente en una casete para tejido; (6) la case- te para tejido se pone entonces manualmente en un dispositivo automático de tratamiento de tejido que, entonces, hace pasar de forma cíclica alcohol, xileno y parafina caliente por la máquina (como se ha descrito en el párrafo precedente) y se ajusta, típicamente, para que funcione durante la noche; (7) a la mañana siguiente, se retira manualmente la casete de la parafina líquida del dispositivo de tratamiento de tejido y se abre; (8) se abre el papel para lentes y se retira por rascado el coágulo de células del papel para lentes y se le pone, manualmente, en un molde de secciones de tejido; y (9) se añade suavemente parafina al molde mientras se intenta mantener, manualmente, el coágulo de células contra la superficie inferior del molde que, eventualmente, se cortará. (10) Se invierte entonces la casete para tejido sobre el molde para que sirva como portador para la máquina de microtomo y se endurece en la cera junto con el coágulo de células. (11) Se separa entonces del molde la casete para tejido, con los fragmentos de células empotrados en cera incluidos. En este punto, el bloque de cera está listo para cortarlo con un microtomo. Muchos de estos once pasos son comunes a otras técnicas existentes para la producción de bloques de células. Otro procedimiento popular para preparar bloques de células es la técnica de la bolsa de colodión, descrita por Fahey y Bedrossian en Laboratory Medicine, 74(2): 94-96 (1993). La técnica de la bolsa de colodión incluye los once pasos antes mencionados a excepción de los pasos 1-4, que son reemplazados por lo siguiente: Se vierte manual- mente colodión en un tubo de centrífuga para revestir el tubo. La muestra de células obtenida del paciente es centri- fugada entonces en el tubo revestido. Se retira por vertido el sobrenadante y se extrae del tubo el delgado revestimiento de colodión con el botón de células concentradas incluido y empotrado, como en los pasos 5-11 anteriores. La técnica del colodión tiene una ventaja con respecto a la técnica del coágulo al evitar la dilución de las células con fibrina y trombina. Con la técnica del colodión, no es necesario esperar a que se forme el coágulo de células, como ocurre con la técnica del coágulo, y las células no son susceptibles a perderse cuando se las retira del tubo de centrífuga. Sin embargo, la técnica del colodión es sustancialmente más peligrosa que la técnica del coágulo, debido a la naturaleza inflamable del colodión y su disolvente de éter. Aún otra técnica para preparar bloques de células la describen Díaz-Rosario... [Seguir leyendo]

1. Un aparato (10) para formar por empotramiento bloques con células por flujo directo, que comprende: una vía (16) de flujo de células definida por un tubo de entrada (20) para entregar fragmentos de células desde una muestra (14) de células a una abertura (26) para muestras, encontrándose la abertura (16) para muestras en comunicación de fluido con una casete (30) para tejido que tiene, unido a ella, un filtro (40), estando configurada la vía (16) para el flujo de células de manera que, al aplicarse una presión, los fragmentos de células sean arrastrados desde la muestra (14) de células a través del tubo de entrada (20), a la abertura (26) para las muestras y sean depositados sobre el filtro (40); y una vía (18) de flujo de reactivos definida por una pluralidad de tubos de entrega de reactivos para entregar los reactivos a una abertura (110) para reactivos en comunicación con la abertura (26) para muestras, en un flujo de reactivos en comunicación con la abertura (26) para muestras, estando configurada la vía (18) de flujo de reactivos de modo que, al aplicarse una presión, los reactivos sean arrastrados a través de los tubos de entrega de reactivos a la abertura (110) para reactivos y a los fragmentos de células depositados en el filtro (40), cuyo aparato se caracteriza por: una fuente (102) de parafina caliente, incluyendo la vía de flujo de reactivos un tubo calentado para la entrega de reactivos, para entregar la parafina caliente a la abertura (26) para las muestras; y caracterizado además por un soporte poroso (60) térmicamente conductor en el que descansa el filtro (40) y un calentador para aplicar calor al soporte (60) durante el proceso de empotramiento. 2. El aparato de la reivindicación 1, en el que el filtro (40) está emparedado entre la casete (30) y el soporte (60) para el filtro y el filtro (40) puede ser retirado de la casete (30) para dejar un disco de cera que sobresalga de la casete (30) con células empotradas en un plano por el que puede cortarse una sección de tejido, por lo que los fragmentos de células se depositan automáticamente cerca de un plano capaz de ser seccionado por un microtomo. 3. El aparato de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la presión aplicada a la vía (18) de flujo de reactivos es una presión negativa; o en el que la presión aplicada a la vía (18) de flujo de reactivos es una presión positiva. 4. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que la presión aplicada a la vía (16) de flujo para las células es una presión negativa o en el que la presión aplicada a la vía (16) de flujo para las células es una presión positiva. 5. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que la vía (18) de flujo de reactivos incluye un tubo de entrega de reactivos para entregar un reactivo seleccionado del grupo consistente en alcohol, xileno, parafina caliente, agua destilada, solución salina, ácido, hematoxilina, eosina y reactivos inmunohistoquímicos. 6. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que cada tubo de entrega de reactivos incluye una bomba (84, 94, 104) para regular el flujo de reactivo a través del tubo. 7. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que cada tubo de entrega de reactivos incluye, además, una abrazadera (86, 96, 106) de tubo con solenoide para formar una vía hermética. 8. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que el filtro comprende policarbonato. 9. El aparato de cualquier reivindicación precedente, en el que la casete (30) para tejido incluye además una abertura cilíndrica (36) configurada para unirla a la abertura (28) para muestras y que se extiende a través de la casete (30) configurada para unión al filtro (40). 10. El aparato de cualquier reivindicación precedente, que incluye además un contenedor (50) para residuos, para recoger al menos uno de la pluralidad de reactivos. 11. Aparato como se reivindica en la reivindicación 10, en el que el contenedor (50) para residuos incluye una abertura para conectar con una fuente de presión. 12. Aparato como se reivindica en la reivindicación 11, en el que la abertura (50) incluye además un manómetro (72). E03768547 27-10-2011   11 E03768547 27-10-2011   12 E03768547 27-10-2011   13 E03768547 27-10-2011   14 E03768547 27-10-2011