Un método para medir el tiempo de coagulación de una muestra de sangre,

que comprende poner en contacto lamuestra de sangre, calcio, y un compuesto seleccionado entre el grupo compuesto por fosfolípido, factor tisular, y uncomplejo de factor tisular y fosfolípido, en presencia de un quelante de calcio,

en el que el quelante de calcio tiene una constante de estabilidad quelante para el calcio inferior que la del ácidocítrico o su sal generalmente usada como anticoagulante y

en el que el quelante de calcio se elige entre el grupo compuesto por ácido maleico, ácido málico, ácido malónico,ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácidosuccínico, ácido fumárico, ácido citracónico, ácido itacónico, ácido tricarbalílico, ácido propano-1,1,2,3-tetracarboxílico, ácido butano-1,2,3,4-tetracarboxílico, ácido glicólico, ácido tioglicólico, ácido tartárico, ácidoisocítrico, ácido pirúvico, ácido oxaloacético, y sales de los mismos,

y medir el tiempo de coagulación de la muestra de sangre.

Método para medir el tiempo de coagulación de una muestra de sangre

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de un reactivo y un método para medir el tiempo de coagulación de una muestra de sangre.

Antecedentes

La coagulación sanguínea es la reacción en que están implicados diversos factores de coagulación sanguínea de la sangre. Mediante esta reacción, el fibrinógeno de la sangre se convierte finalmente en fibrina. El tiempo requerido para la coagulación sanguínea (a partir de ahora en este documento mencionado a veces como tiempo de coagulación sanguínea) puede medirse para examinar, por ejemplo, carencias y anormalidades de diversos factores de coagulación sanguínea. En base al tiempo de coagulación sanguínea, también puede examinarse la tendencia hemorrágica de un paciente.

Habitualmente, se estima que la coagulación sanguínea sucede a través de las siguientes vías (véase la FIG. 1) . Es decir, la primera vía es una vía llamada coagulación extrínseca (factor tisular) . Partiendo de la liberación de tromboplastina tisular (también llamada factor tisular) por las células epidérmicas o similares, se activa el factor de coagulación VII mediante la tromboplastina tisular. Este factor de coagulación VII activado activa el factor de coagulación X. Éste activa el factor de coagulación V y el factor II, y finalmente el fibrinógeno se convierte en fibrina. El tiempo de coagulación sanguínea en esta vía puede medirse mediante un método de medición del tiempo de protrombina (PT) .

La segunda vía es una vía llamada coagulación intrínseca (factor de contacto) . En la vía de coagulación intrínseca, el factor de coagulación XII se activa, por ejemplo, por contacto con una superficie cargada negativamente de una materia foránea tal como colágeno. A su vez, el factor XII activado activa el factor XI. El factor XI activada a su vez activa el factor IX, y el factor IX activado activa el factor X con una acción colaborativa de iones calcio y el factor VIII. Después, se activan secuencialmente el factor V y el factor II, y finalmente el fibrinógeno se convierte en fibrina. El tiempo de coagulación sanguínea en esta vía puede medirse por un método de tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) .

El calcio y los fosfolípidos (PL) están implicados en ambas vías.

Los métodos conocidos para medir el tiempo de coagulación sanguínea incluyen un método de medición óptica que comprende mezclar una muestra de sangre que contiene factores de coagulación con un reactivo que contiene fosfolípido (PL) y calcio para causar la coagulación sanguínea y detectar la formación de fibrina como un cambio óptico. El método de medición de PT o el método de medición de APTT es un tipo de método de medición óptica.

En dicho método de medición óptica, el cambio óptico habitualmente es muy bajo después de añadir un reactivo para medir la coagulación sanguínea a una muestra de sangre para iniciar la reacción de coagulación sanguínea hasta que la reacción procede a formar fibrina. Después, sucede un rápido cambio óptico dentro de un corto tiempo después de la formación de fibrina.

Sin embargo, el calcio contenido en un reactivo para medir la coagulación sanguínea a veces puede reaccionar con una sustancia diferente de los factores de coagulación sanguínea contenidos en una muestra de sangre para generar aglutinación. La sustancia diferente a los factores de coagulación sanguínea que reacciona con el calcio incluye, por ejemplo, proteína C reactiva (CRP) y componentes lipídicos (por ejemplo, lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) ) contenidos en una muestra de sangre. Cuando se genera la aglutinación mediante dicha reacción, la aglutinación se detecta como un cambio óptico en una fase inicial de la medición, y el cambio óptico a veces puede reconocerse erróneamente como coagulación sanguínea (Toh, CH et al., Blood, 100 (7) , pág. 2522-2529 (2002) ) .

El documento US2003/138962 describe un método para detectar una anormalidad en una reacción temprana en medición óptica de la coagulación sanguínea estableciendo al menos un punto de control o región de control desde el inicio de la medición hasta el final de la reacción de coagulación.

Sin embargo, no ha habido un reactivo capaz de medir de forma precisa el tiempo de coagulación sanguínea suprimiendo la generación de un cambio óptico en una fase inicial de la medición que se ha descrito anteriormente.

Sumario

El reactivo para medir el tiempo de coagulación comprende un quelante de calcio. Este quelante de calcio puede interferir con la reacción entre el calcio y una sustancia diferente de un factor de coagulación en la muestra de sangre, sin interferir esto sustancialmente con la reacción de coagulación.

El kit reactivo para medir el tiempo de coagulación comprende un primero y un segundo reactivos. El primer reactivo comprende al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por tromboplastina parcial, tromboplastina tisular, y complejo de factor tisular y fosfolípido. El segundo reactivo comprende calcio. En el primer reactivo, el segundo reactivo o ambos, se incluye un quelante de calcio. Este quelante de calcio puede interferir con la reacción entre el calcio y una sustancia diferente de un factor de coagulación en la muestra de sangre, sin interferir esto sustancialmente con la reacción de coagulación.

El método para medir el tiempo de coagulación de acuerdo con la presente invención comprende una etapa de contacto y una etapa de medición. La etapa de contacto es poner en contacto la muestra de sangre, calcio, y un compuesto seleccionado entre el grupo compuesto por tromboplastina parcial, tromboplastina tisular, y complejo de factor tisular y fosfolípido, en presencia de un quelante de calcio. Este quelante de calcio puede interferir con la reacción entre el calcio y una sustancial diferente de un factor de coagulación en la muestra de sangre, sin interferir esto sustancialmente con la reacción de coagulación. La etapa de medición es medir el tiempo de coagulación de la muestra de sangre.

El uso del reactivo para medir la coagulación sanguínea y el método para medir el tiempo de coagulación sanguínea de acuerdo con la presente invención pueden usarse para medir el tiempo de coagulación sanguínea suprimiendo la generación de un cambio óptico en una fase inicial de la medición. Por consiguiente, la coagulación sanguínea puede medirse de forma más precisa que por métodos convencionales para medir el tiempo de coagulación sanguínea.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama que muestra dos vías principales de coagulación sanguínea. La Fig. 2 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de referencia 1. La Fig. 3 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento de referencia 2. La Fig. 4 es un gráfico que muestra los resultados del experimento 1.

Descripción de las realizaciones preferidas

La muestra de sangre usada en la medición de la coagulación sanguínea se prepara habitualmente añadiendo un anticoagulante, tal como citrato sódico, a la sangre (sangre completa o plasma) recogida de un paciente. Como el anticoagulante contenido en la muestra de sangre influye en la reacción en la medición de la coagulación sanguínea, se elimina la influencia del anticoagulante permitiendo que esté habitualmente presente una gran cantidad de calcio en el sistema de medición de la coagulación sanguínea para que el calcio se una al anticoagulante, interfiriendo de este modo con la acción del anticoagulante.

El calcio también es un componente esencial para permitir que proceda la reacción de coagulación sanguínea como se muestra en la FIG. 1. Es decir, el calcio presente en exceso en el sistema de medición de la coagulación sanguínea, junto con el fosfolípido (PL) que se permite que esté presente en el sistema de medición de la coagulación sanguínea, reacciona con los factores de coagulación sanguínea en la muestra de sangre activándolos de este modo de modo que proceda la reacción de coagulación sanguínea.

Un exceso de calcio que no reaccione con el anticoagulante o no se use en la reacción de coagulación sanguínea se aglutina reaccionando con sustancias en la muestra de sangre tales como partículas lipídicas de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y proteína C reactiva (CRP) u otras diferentes... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir el tiempo de coagulación de una muestra de sangre, que comprende poner en contacto la muestra de sangre, calcio, y un compuesto seleccionado entre el grupo compuesto por fosfolípido, factor tisular, y un complejo de factor tisular y fosfolípido, en presencia de un quelante de calcio, en el que el quelante de calcio tiene una constante de estabilidad quelante para el calcio inferior que la del ácido cítrico o su sal generalmente usada como anticoagulante y en el que el quelante de calcio se elige entre el grupo compuesto por ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido citracónico, ácido itacónico, ácido tricarbalílico, ácido propano-1, 1, 2, 3tetracarboxílico, ácido butano-1, 2, 3, 4-tetracarboxílico, ácido glicólico, ácido tioglicólico, ácido tartárico, ácido isocítrico, ácido pirúvico, ácido oxaloacético, y sales de los mismos, y medir el tiempo de coagulación de la muestra de sangre.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre se pone en contacto con al menos un activador seleccionado entre el grupo compuesto por ácido elágico, caolín, celite, sílice coloidal, anhídrido silícico, alúmina y magnesio en la etapa de contacto.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el quelante de calcio es al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por ácido maleico, ácido málico, y sales de los mismos.

4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de quelante de calcio en una mezcla de calcio, fosfolípido y muestra de sangre es de 0, 8 a 6 veces la concentración del calcio.

5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tiempo de coagulación se mide detectando una información óptica de una mezcla de calcio, fosfolípido y muestra de sangre.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tiempo de coagulación se mide detectando un cambio de una información óptica de una mezcla de calcio, fosfolípido y muestra de sangre.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la información óptica se selecciona entre el grupo compuesto por luz transmitida y luz dispersada.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el método es para la medición del tiempo de protrombina, la medición del tiempo de tromboplastina parcial activado, la medición de anticoagulante lúpico, trombotest, hepaplastintest, o la cuantificación de factor de coagulación.

9. Uso de un reactivo que comprende un quelante de calcio en un método para la medición del tiempo de coagulación de una muestra de sangre, en el que dicho método comprende poner en contacto la muestra de sangre, calcio, y un compuesto seleccionado entre el grupo compuesto por fosfolípido, factor tisular, y un complejo de factor tisular y fosfolípido, en presencia de dicho quelante de calcio, y medir el tiempo de coagulación de la muestra de sangre, y en el que dicho quelante de calcio se elige entre el grupo compuesto por ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido citracónico, ácido itacónico, ácido tricarbalílico, ácido propano1, 1, 2, 3-tetracarboxílico, ácido butano-1, 2, 3, 4-tetracarboxílico, ácido glicólico, ácido tioglicólico, ácido tartárico, ácido isocítrico, ácido pirúvico, ácido oxaloacético, y sales de los mismos.

10. Uso de un kit reactivo que comprende un primero y un segundo reactivos, en el que el primer reactivo comprende al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por fosfolípido, factor tisular, y un complejo de factor tisular y fosfolípido, y el segundo reactivo comprende calcio, en el que un quelante de calcio está comprendido en el primer reactivo, el segundo reactivo o ambos, en un método para la medición del tiempo de coagulación de una muestra de sangre, en el que dicho método comprende poner en contacto dicha muestra de sangre, dicho primer reactivo, dicho segundo reactivo y dicho quelante de calcio, y medir el tiempo de coagulación de la muestra de sangre, y en el que dicho quelante de calcio se elige entre el grupo compuesto por ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido citracónico, ácido itacónico, ácido tricarbalílico, ácido propano1, 1, 2, 3-tetracarboxílico, ácido butano-1, 2, 3, 4-tetracarboxílico, ácido glicólico, ácido tioglicólico, ácido tartárico, ácido isocítrico, ácido pirúvico, ácido oxaloacético, y sales de los mismos.

11. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el quelante de calcio es al menos uno seleccionado entre el grupo compuesto por ácido maleico, ácido málico, y sales de los mismos.

12. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 11, en el que la concentración de quelante de calcio en una mezcla de calcio, fosfolípido y muestra de sangre es de 0, 8 a 6 veces la concentración del calcio.

13. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 12, en el que el tiempo de coagulación se mide detectando una

información óptica de una mezcla de calcio, fosfolípido y muestra de sangre.

14. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 12, en el que el tiempo de coagulación se mide detectando un

cambio de una información óptico de una mezcla de calcio, fosfolípido y muestra de sangre. 5

15. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 13 ó 14, en el que la información óptica se selecciona entre el grupo compuesto por luz transmitida y luz dispersada.

16. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 15, en el que el método se para la medición del tiempo de

protrombina, la medición del tiempo de tromboplastina parcial activado, la medición de anticoagulante lúpico, trombotest, hepaplastintest, o la cuantificación de factor de coagulación.