Método para la producción de ácido araquidónico y/o ácido eicosapentanoico en plantas útiles transgénicas.

Método para la producción de

(i) ácido eicosapentanoico o

(ii) ácido araquidónico y ácido eicosapentanoico

en los tejidos vegetativos de plantas útiles transgénicas con un contenido de por lo menos 4 % en peso referido al contenido total de lípidos de la planta útil transgénica,

caracterizado porque en la planta se introducen por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una Δ-6-desaturasa, por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una Δ-6-elongasa y por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una Δ-5-desaturasa donde los ácidos nucleicos son elegidos de entre el grupo consistente en

a) Secuencias de ácidos nucleicos con las secuencias representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7;

b) Secuencia de ácidos nucleicos, la cual se deriva como resultado de los códigos genéticos generados de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8; y

c) derivados de las secuencias de ácidos nucleicos representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 las cuales codifican para polipéptidos, las cuales en el plano de aminoácidos exhiben una identidad de por lo menos 70 % con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 y tienen una actividad de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, o Δ-5-desaturasa;

donde las mencionadas secuencias se expresan en las plantas con ayuda de por lo menos un promotor constitutivo CaMV/35S el cual hace posible la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos en tejidos vegetativos de plantas, y un terminador

Metodo para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico en plantas utiles transgenicas.

La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico en tejidos vegetativos de plantas utiles transgenicas, en lo cual se introducen acidos nucleicos en la planta, los cuales codifican para polipeptidos con actividad de M-6-desaturasa, M-6-elongasa y A-5desaturasa. De modo ventajoso ademas en las plantas utiles se expresa un gen que codifica para una w-3desaturasa. En otra forma ventajosa de operar del metodo, pueden expresarse en las plantas otras secuencias de acidos nucleicos, que codifican para polipeptidos de la biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos. Para esto son particularmente ventajosas las secuencias de acidos nucleicos, que codifican para una actividad de M-8desaturasa, M-12-desaturasa, M-15-desaturasa, M-4-desaturasa, M-9-elongasa y/o M-5-elongasa.

Los acidos grasos y triacilgliceridos tiene una multiplicidad de aplicaciones en la industria de los alimentos, la nutricion animal, los cosmeticos y el campo farmaceutico. De acuerdo con si se trata de acidos grasos saturados e insaturados o de triacilgliceridos con un elevado contenido de acidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para diferentes aplicaciones. Muchas veces los acidos grasos w-3 insaturados y acidos grasos w-6 insaturados son un componente importante en la alimentacion animal y humana.

Muchas veces los acidos grasos w-3 insaturados de cadena larga como acido eicosapentanoico (= EPA, C20A M5, 8, 11, 14, 17) o acido docosahexenoico (= DHA, C22A6M4, 7, 10, 13, 16, 19) son componentes importantes de la nutricion humana debido a sus diferentes papeles en la salud, que incluyen aspectos como el desarrollo cerebral infantil, el funcionamiento de los ojos, la sintesis de hormonas y otras sustancias semioquimicas, asi como la prevencion de desordenes cardiovasculares, cancer y diabetes (Poulos, A Lipids 30A1-14, 1995; Horrocks, LA y Yeo YK Pharmacol Res 40A 211-225, 1999) . Por esta razon existe una necesidad de la produccion de acidos grasos de cadena larga poliinsaturados.

Debido a la composicion comun actual de la alimentacion humana es particularmente importante para la nutricion, una adicion de acidos grasos poliinsaturados w-3, los cuales ocurren preferiblemente en aceites de pescado. De este modo, para elevar el valor nutricional se anaden a los alimentos infantiles por ejemplo acidos grasos poliinsaturados como acido docosahexanoico (= DHA, C22A6M4, 7, 10, 13, 16, 19) o acido eicosapentanoico (= EPA,

C20A5M5, 8, 11, 14, 17) .

En lo que sigue se denominan los acidos poliinsaturados como PUFA, PUFAs, LCPUFA o LCPUFAs (poliunsaturated tatty acids, PUFA, acidos grasos poliinsaturados; long chain poliunsaturated tatty acids, LC- PUFA, acidos grasos poliinsaturados de cadena larga) .

Principalmente, se obtienen los diferentes acidos grasos y trigliceridos a partir de microorganismos como Mortierella o Schizochytrium o a partir de plantas que producen aceite como soja, colza, algas como Cr y pthecodinium o Faeodactilum y otros, donde por regla general se presentan en forma de sus triacilgliceridos (= trigliceridos = trigliceroles) . Ellos pueden ser obtenidos tambien a partir de animales como por ejemplo pescados. Los acidos grasos libres son obtenidos ventajosamente mediante saponificacion. Los acidos grasos de cadena larga con muchas insaturaciones como EPA, acido dihomo-y- linolenico (C20A353M8, 11, 14) o acido araquidonico (= ARA, C20A4M5, 8, 11, 14) no son sintetizados en plantas oleaginosas como colza, soja, girasol, cartamo. Son fuentes naturales comunes de estos acidos grasos los pescados como arenque, salmon, sardina, gallineta nordica, anguila, carpa, trucha, rodaballo, macarela, lucio o atun o algas.

Dependiendo del proposito de aplicacion se prefieren aceites con acidos grasos saturados o insaturados. De este modo en la nutricion humana se prefieren por ejemplo lipidos con acidos grasos insaturados, especialmente acidos grasos poliinsaturados. A los acidos grasos poliinsaturados w-3 se les atribuye en ello un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en la sangre y con ello las posibilidades de prevencion de una enfermedad del corazon. Mediante la adicion de estos acidos grasos w-3 a la alimentacion puede disminuirse claramente el riesgo de una enfermedad de corazon, un ataque de apoplejia o de elevada presion arterial. Tambien, mediante los acidos grasos w-3 puede influirse positivamente en los procesos inflamatorios cronicos especiales en el marco de enfermedades inmunologicas como artritis reumatoide. Por ello, son anadidos a los alimentos dieteticos especiales o encuentran aplicacion en medicamentos.

Los acidos grasos w-3- y w-6 son precursores de hormonas tisulares, los denominados eicosanoides como las prostaglandinas, que se derivan del acido dihomo-y-linolenico, del acido araquidonico y del acido eicosapentanoico, los tromoxanos y leucotrienos, los cuales se derivan del acido araquidonico y el acido eicosapentanoico. Los eicosanoides (denominados serie PG2) , que estan formados de acidos grasos w-6 promueven por regla general reacciones de inflamacion mientras que los eicosanoides (denominados serie PG3) de acidos grasos w-3 tienen bajo

o ningun efecto promotor de la inflamacion.

Debido a sus propiedades positivas no han faltado intentos en el pasado para hacer disponibles genes que participan en la sintesis de acidos grasos o bien de trigliceridos, para la produccion en diferentes organismos de aceites con contenido modificado de acidos grasos insaturados. De este modo en la WO 91/13972 y su equivalente en los Estados Unidos se describe una M-9-desaturasa. En WO 93/11245 se reivindica una M-15-desaturasa, enWO 94/11516 se reivindica una 55 M-12-desaturasa. Por ejemplo en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990A 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990A 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999A 649-659 se describen otras desaturasas. Por regla general la caracterizacion de desaturasas unidas a la membrana ocurre mediante incorporacion en un organismo adecuado, al cual se le determina a continuacion la actividad enzimatica por medio de analisis de reactantes y productos. Las desaturasas M-6 son descritas en WO 93/06712, US 5, 614, 393, US5614393, WO 96/21022, WO00/21557 y WO 99/27111 y tambien la aplicacion para la produccion de organismos transgenicos, como en WO98/46763 WO98/46764, WO9846765. En ello se reivindica y describe tambien la expresion de diferentes desaturasas como en WO99/64616 o WO98/46776 y la formacion de acidos grasos poli insaturados.

Los acidos grasos poliinsaturados pueden, de acuerdo a su patron de desaturacion, ser divididos en dos grandes categorias, en acidos grasos w-6- o w-3, los cuales tienen actividades metabolicas y funcionales diferentes. Por ejemplo en WO0159128, WO0012720, WO02077213 y WO0208401 se describe la sintesis de los acidos grasos w6 u w-3 acido araquidonico y EPA por diferentes vias de biosintesis en microorganismos como levaduras.

Como producto de partida para la ruta metabolica w-6 funciona el acido graso acido linoleico (18A2M9, 12) , mientras que la ruta w-3 transcurre por acido linolenico (18A3M9, 12, 15) . En ello, el acido linolenico es formado mediante actividades de una desaturasa w-3- (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117 ; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113) .

Los mamiferos y con ello tambien los seres humanos no disponen de ninguna actividad correspondiente de desaturasa (desaturasa M-12 y w-3) y tienen que tomar estos acidos grasos (acidos grasos esenciales) mediante la alimentacion. Mediante la sucesion de reacciones de desaturasa y elongasa se sintetizan entonces de estas etapas los acidos grasos poliinsaturados fisiologicamente importantes, acido araquidonico (= ARA, 20A4M5, 8, 11, 14) , un acido graso w-6, y el acido graso w-3 acido eicosapentanoico (= EPA, 20A5M5, 8, 11, 14, 17) . cComo se describio arriba, la aplicacion de los acidos grasos w-3 muestra en ello el efecto terapeutico en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108) , inflamaciones (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358) y artritis (Cleland y James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307) .

Los metodos conocidos hasta ahora para la produccion de acido araquidonico y/o acido eicosapentanoico poseen algunas desventajas. Por regla general, en los metodos ambos acidos grasos son obtenidos como una mezcla.... [Seguir leyendo]

1. Metodo para la produccion de

(i) acido eicosapentanoico o

(ii) acido araquidonico y acido eicosapentanoico

en los tejidos vegetativos de plantas utiles transgenicas con un contenido de por lo menos 4 % en peso referido al contenido total de lipidos de la planta util transgenica, caracterizado porque en la planta se introducen por lo menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica para una M-6-desaturasa, por lo menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica para una M-6-elongasa y por lo menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica para una M-5-desaturasa donde los acidos nucleicos son elegidos de entre el grupo consistente en

a) Secuencias de acidos nucleicos con las secuencias representadas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5 o SEQ ID NOA 7;

b) Secuencia de acidos nucleicos, la cual se deriva como resultado de los codigos geneticos generados de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6 o SEQ ID NOA 8; y

c) derivados de las secuencias de acidos nucleicos representadas en SEQ ID NOA 1, SEQ ID NOA 3, SEQ ID NOA 5 o SEQ ID NOA 7 las cuales codifican para polipeptidos, las cuales en el plano de aminoacidos exhiben una identidad de por lo menos 70 % con SEQ ID NOA 2, SEQ ID NOA 4, SEQ ID NOA 6 o SEQ ID NOA 8 y tienen una actividad de M-6-desaturasa, M-6-elongasa, o M-5-desaturasa;

donde las mencionadas secuencias se expresan en las plantas con ayuda de por lo menos un promotor constitutivo CaMV/35S el cual hace posible la expresion de dichas secuencias de acidos nucleicos en tejidos vegetativos de plantas, y un terminador.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque adicionalmente se incorpora en las plantas utiles una secuencia de acidos nucleicos la cual codifica para una w-3-desaturasa.

3. Metodo segun la reivindicacion 2, caracterizado porque la secuencia de acidos nucleicos que codifica para polipeptidos con actividad de w-3-desaturasa, es elegida de entre el grupo consistente en

a) una secuencia de acidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NOA 9, o

b) secuencias de acidos nucleicos, las cuales como resultado del codigo genetico degenerativo se derivan de las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NOA 10 o

c) derivados de las secuencias de acidos nucleicos representadas en SEQ ID NOA 9 que codifican para polipeptidos, las cuales a nivel de aminoacidos exhiben una identidad de por lo menos 60 % con SEQ ID NOA 10 y tienen una actividad de w-3-desaturasa.

4. Metodo segun las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico estan presentes en las plantas utiles, preferiblemente unidos como esteres en fosfolipidos o triacilgliceridos.

5. Metodo segun la reivindicacion 4, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico estan presentes predominantemente unidos como esteres a los fosfolipidos y donde el acido araquidonico o acido eicosapentanoico estan presentes en los esteres de fosfolipidos con un contenido de por lo menos 10 % en peso referido a la totalidad de los lipidos.

6. Metodo segun la reivindicacion 4, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico estan presentes predominantemente unidos como esteres a los triacilgliceridos y donde el acido araquidonico o acido eicosapentanoico estan presentes en los esteres de triacilgliceridos con un contenido de por lo menos 10 % en peso referido a la totalidad de lipidos.

7. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque las plantas utiles son una planta productora de aceite, una hortaliza, verdura o planta ornamental.

8. Metodo segun la reivindicacion 7, caracterizado porque las plantas utiles son elegidas de entre las familias de plantas consistentes en familias de las Aceraceae, Actinidiaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Arecaceae, pritoliaceae, Chenopodiaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Eu-torbiaceae, Fabaceae, Fagaceae, Grossulariaceae, Juglandaceae, Lauraceae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Moraceae,

Musaceae, Oleaceae, Oxalidaceae, Papaveraceae, Poaceae, Poligonaceae, Punicaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Sterculiaceae y Valerianaceae.

9. Metodo segun las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque el acido eicosapentanoico o acido araquidonico y acido eicosapentanoico son aislados de las plantas utiles en forma de sus aceites, lipidos o acidos grasos libres.

10. Metodo segun las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en las plantas utiles se introducen

adicionalmente otros genes de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos, elegidos de entre el grupo de acil-CoA-dehidrogenasa (s) , acil-ACP[=proteina portadora de acilo]-desaturasa (s) , acil-ACP-tioesterasa (s) , aciltransferasa (s) de acidos grasos, acil-CoAAlisofosfolipid-aciltransferasas, sintetasa (s) de acidos grasos, hidroxilasa (s) de acidos grasos, acetil-coenzima A-carboxilasa (s) , acil-coenzima A-oxidasa (s) , desaturasa (s) de acidos grasos, acetilenasas de acidos grasos, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, sintetasas de oxido de aleno, hidroperoxido

liasas o elongasa (s) de acidos grasos.

11. Metodo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque los genes adicionales de biosintesis del metabolismo de acidos grasos o lipidos son elegidos de entre el grupo de las M-4-desaturasa, M-5-desaturasa, M-6-desaturasa, M8-desaturasa, M-9-desaturasa, M-12-desaturasa, M-6-elongasa o M-9-elongasa.

Figura 1: Vectores empleados para la transformación de plantas