Método in vitro para la determinación de perfiles de expresión génica en una muestra tomada de un cuerpohumano en un método para la diferenciación entre enfermedad inflamatoria del intestino (EII) y síndrome del intestinoirritable (SII) en un paciente,

en el que al menos dos genes marcadores se eligen de los siguientes genes y sus correspondientes proteínas:

Gen: SEQ.ID.NO. N.º DE REG. DE PROTEÍNA

SLC6A14 NM_007231 NP_009162

SLC26A2 NM_000112 NP_000103

GRO-1 NM_001511 NP_001502

MMP-7 BC003635 NP_002414

MAP-17 NM_005764 NP_005755

RegIV BC017089 NP_114433

vanina 1 NM_004666 NP_004657

y en el que se determinan los niveles de expresión de dichos al menos dos genes y sus correspondientes proteínas paraobtener un perfil de expresión y en el que el perfil de expresión se compara con los perfiles de expresión de muestras depacientes con EII y SII conocidos.

Metodo para la diferenciacion de Ell y Sll y la distincion adicional entre tipos patologicos de Ell

La presente invencion se refiere a un metodo para su uso en el diagnostico de enfermedad inflamatoria del intestino usando un enfoque multigenico. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo para su uso e n el 5 diagnostico y/o la diferenciacion de enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) de sindrome del intestino inflamatorio (Sll) determinando la expresion de al menos un gen o genes marcadores especificos, por ejemplo usando oligonucleotidos que amplifican especificamente dichos genes marcadores, o determinando la expresion de las correspondientes proteinas, por ejemplo usando anticuerpos que reconocen especificamente las proteinas codificadas por dicho gen o genes marcadores especificos. El metodo de diagnostico puede usarse ventajosamente en el diagnostico y la diferenciacion

tempranos de estas enfermedades debido a la precision y reproducibilidad mejoradas.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) describe un estado de inflamacion intestinal con recaida cronica. La comprension actual de la patogenia de la enfermedad sugiere una interaccion compleja de multiples factores ambientales y geneticos. Provoca una morbilidad significativa en poblaciones de origen europeo, teniendo las dos formas principales

(enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU) ) una prevalencia combinada de 150-250/10.000. Ambas formas de Ell tienen una incidencia maxima al comienzo de la vida adulta pero puede desarrollarse en cualquier etapa. Afectan a ambos sexos en una extension aproximadamente igual. Los factores de riesgo ambientales para el desarrollo de Ell estan escasamente definidos. El factor mejor caracterizado es el tabaquismo, que aumenta claramente el riesgo de desarrollar la enfermedad de Crohn pero protege frente a la colitis ulcerosa, por motivos que no estan claros.

El tratamiento de la enfermedad es un compromiso a largo plazo tanto para el paciente como para el medico, puesto que actualmente no hay ninguna cura para ningun estado. Aproximadamente el 30% de los pacientes con Ell se someten a cirugia durante su vida y los pacientes con Ell de larga evolucion corren un riesgo considerable de desarrollar cancer colorrectal. Tres de cada diez pacientes con Ell no responden a la principal terapia medica disponible hoy en dia, incluso cuando se usan dosis altas, provocando efectos secundarios considerables.

La colitis ulcerosa provoca normalmente sintomas de diarrea hemorragica y urgencia fecal. La inflamacion implica al recto, y puede extenderse de manera continua a partes de, o todo el co lon proximal. El examen histologico revela un infiltrado de celulas inflamatorias cronicas, que se limitan a las capas superficiales de la mucosa colonica. Los granulomas no son una caracteristica. La enfermedad de Crohn es bastante mas pleomorfica. Se caracteriza patologicamente por segmentos discontinuos de inflamacion transmural, que pueden afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal

desde la boca hasta el ano, pero que implican de la manera mas comun la region ileocecal. Los granulomas son un distintivo histologico pero las caracteristicas clinicas son bastante variables dependiendo del sitio de afectacion del intestino. Si el colon esta inflamado, los sintomas pueden imitar exactamente a los de la colitis ulcerosa.

Es obvio que una posibilidad de distinguir que clinicamente CU de EC colonica en un estadio temprano proporcionaria enormes beneficios tanto al paciente como al medico. Permitiria el disefo de regimenes de tratamiento precisos, impe

diria el uso de medicamentos innecesarios y reduciria los costes de tratamiento.

El sindrome del intestino irritable, o Sll, tambien es un trastorno gastrointestinal en el que los musculos lisos de la pared intestinal se vuelven hipersensibles a desencadenantes tales como estres o incluso cafe y provocan meteorismo, nauseas, vomitos y estrefimiento o diarrea. Desafortunadamente, como muchos de los sintomas son similares a los de Ell, Sll a menudo se diagnostica mal.

Existen unos cinco millones de casos de Sll en los EE.UU. solo. Permitir que se distinga Sll de los casos de Ell mas graves reduciria el numero de visitas innecesarias al medico por parte de los pacientes con Sll que se sospecha que tienen Ell. Tambien ayudaria al medico a elegir el tipo de tratamiento mas apropiado.

La bibliografia de patentes indica que los metodos disponibles para distinguir entre diferentes formas de Ell, y en particular la diferenciacion entre CU y EC, aparte de los ejemplos facilitados anteriormente de diferentes procedimientos de

45 examen, se han centrado en metodos basados en anticuerpos.

Por ejemplo, el documento WO 03/036262 describe un metodo y kit que se proporcionan para la diferenciacion de EC de otras dolencias gastrointestinales, tales como CU y Sll, usando la presencia de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae fecales (ASCA) como marcador para la enfermedad de Crohn. El kit incluye un inmunoensayo ligado a enzimas y otro inmunoensayo que utiliza anticuerpos especificos para inmunoglobulinas humanas para la medicion de ASCA

50 endogenos totales en una muestra fecal humana.

El documento WO01/58927 describe metodos de diagnostico para detectar enfermedades asociadas con una respuesta de autoantigeno frente a hTM en tejido afectado, y en particular CU.

Otro enfoque de anticuerpos estudiado intensamente (veanse las patentes estadounidenses 5.691.151; 5.830.675; y 6.033.864) son los autoanticuerpos frente a neutrofilos (anticuerpos citoplasmaticos anti-neutrofilos perinucleares atipi

55 cos) P-ANCA. Se encuentran principalmente en CU (50-67%) pero tambien en EC (6-15%) . Se penso que la combina

cion de ANCA y ASCA seria muy util en pacientes con colitis indeterminada. Pero un hallazgo notable fue que aproximadamente el 50% de los pacientes con colitis indeterminada son pacientes seronegativos. Esto significa que no desarrollan anticuerpos para ASCA yANCA y, por tanto, no pueden diagnosticarse durante, en promedio, casi 10 afos (Bossuyt X., Clin Chem 2006, 52:2, 171-181)

El documento WO 2004/001073 describe los siete genes referidos en la presente invencion como marcadores de diagnostico para CU. La expresion de estos marcadores a nivel de ARN se determina en biopsias de mucosa del colon.

Sumario de la invencion

Sigue existiendo una necesidad de metodos mejorados para la seleccion precisa, rapida y fiable de pacientes que notifican problemas gastrointestinales, y para distinguir entre pacientes con Ell y sin Ell, por ejemplo pacientes que padecen Sll. Seria particularmente deseable, tanto desde una perspectiva de un paciente como de un hosp ital, si pudiera realizarse una primera seleccion antes de que el paciente se remita a un examen ileocolonoscopico.

Tambien existe una necesidad de diagnostico de colitis ulcerosa, en particular en el contexto de la distincion entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn en pacientes con Ell.

Un objetivo de la presente invencion es poner a disposicion metodos segun se reivindica para estos fines. Un objetivo particular es poner a disposicion un metodo que hace posible alcanzar un diagnostico fiable en un estadio temprano de la enfermedad. Otro objetivo es poner a disposicion un metodo para un metodo fiable y aun simplificado y menos invasivo para seguir la respuesta al tratamiento y que confirme la mejora en un paciente que se somete a tratamiento.

Otro objetivo es hacer posible realizar una primera seleccion usando tecnicas de toma de muestras no invasivas o minimamente invasivas, en contraposicion a las biopsias o el examen ileocolonoscopico usados normalmente. Tambien el examen con enema de bario debe clasificarse como procedimiento invasivo, debido a las considerables molestias y tension que se ejercen sobre el paciente. Tambien es un objetivo poner a disposicion metodos segun se exponen en las reivindicaciones para distinguir entre Ell y Sll, y EC y CU tambien en casos dificiles, en los que el cuadro clinico puede ser muy similar.

Objetivos adicionales subyacentes a la invencion, asi como las soluciones ofrecidas por la invencion y las ventajas asociadas resultaran evidentes para un experto tras el estudio de la descripcion, los ejemplos y las reivindicaciones.

Los... [Seguir leyendo]

REIvINDICaCIoNES

1. Metodo in vitro para la determinacion de perfiles de expresion genica en una muestra tomada de un cuerpo humano en un metodo para la diferenciacion entre enfermedad inflamatoria del intestino (Ell) y sindrome del intestino irritable (Sll) en un paciente, en el que al menos dos genes marcadores se eligen de los siguientes genes y sus correspondientes proteinas:

Gen: SEQ.lD.NO. N.D DE REG. DE PROTEiNA

SLC6A14 NM 007231 NP 009162

SLC26A2 NM 000112 NP 000103

GRO-1 NM 001511 NP 001502

MMP-7 BC003635 NP 002414

MAP-17 NM 005764 NP 005755

ReglV BC017089 NP 114433

vanina 1 NM 004666 NP 004657

y en el que se determinan los niveles de expresion de dichos al menos dos genes y sus correspondientes proteinas para

obtener un perfil de expresion y en el que el perfil de expresion se compara con los perfiles de expresion de muestras de pacientes con Ell y Sll conocidos.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se determina el nivel de expresion de los siete marcadores.

3. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que uno de dichos al menos dos marcadores es SLC26A2 y en el que SLC26A2 se expresa a un nivel menor en Ell en comparacion con en Sll.

4. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que uno de dichos al menos dos marcadores es GRO-1 y en el que GRO-1 se expresa a un nivel mayor en Ell en comparacion con en Sll.

5. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha muestra es una de una muestra de heces, sangre, plasma, suero y una muestra de biopsia.

6. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la muestra es una muestra de heces y uno de dichos al menos dos marcadores es MAP-17 y en el que MAP-17 se expresa a un nivel menor en Ell en comparacion con en Sll.

7. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la muestra es una muestra de heces y uno de dichos al menos dos marcadores es ReglV y en el que ReglV se expresa a un nivel menor en Ell en comparacion con en Sll.

8. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha muestra es una muestra de heces y dichos al menos dos marcadores son SLC6A14 y GRO-1 yen el que SLC6A14 se expresa a un nivel menor que GRO-1 en Ell y a un nivel mayor que GRO-1 en Sll.

9. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha muestra es una muestra de heces y dichos al menos dos marcadores son GRO-1 y MAP-17 y en el que GRO-1 se expresa a un nivel mayor que MAP-17 en Ell y a un nivel menor que MAP-17 en Sll.

10. Metodosegun la reivindicacion 5, en el que dicha muestra es una muestra de heces y dichos al menos dos marcadores son GRO-1 y ReglV y en el que GRO-1 se expresaa un nivel mayor que ReglV en Ell y a un nivel menor que ReglV en Sll.

11. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la muestra es una muestra de sangre y uno de dichos al menos dos marcadores es vanina 1.

12. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que, en un caso en el que se indica Ell, sedetermina el perfil de ex presion de al menos dos de los genes marcadores en una muestra de biopsia y se usa para la diferenciacion entre colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC) y en el que

SLC6A14 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; SLC26A2 se expresa a un nivel menor en CU en comparacion con EC; GRO-1 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; MMP-7 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC;

MAP-17 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; ReglV se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC; y vanina 1 se expresa a un nivel mayor en CU en comparacion con EC

13. Metodo segun la reivindicacion 12, en el que se usa el perfil de expresion genica de al menos dos marcadores para una distincion entre una fase activa y pasiva de colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.

14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que dichos al menos dos marcadores son SLC6A14 y GRO-1.

15. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que dichos al menos dos marcadores son ReglV y vanina 1.