Método para incrementar la resistencia frente a hongos biotrópicos en vegetales.

Método para generar o elevar una resistencia frente a al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora enuna planta o una parte de una planta,

en cuyo caso la parte de una planta comprende un tejido o una célula, el cualcomprende los pasos:

(a) elevar la cantidad o función de la proteína de al menos una proteína inhibidora - 1 Bax (BI1) en la planta o almenos una parte de una planta frente a la cantidad o función de proteína en la planta de partida o en sus partes, encuyo caso

(i) se transforman células vegetales de manera estable con un casete de expresión recombinante que contiene unasecuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína BI1, en conexión funcional con un promotor, en cuyo caso elpromotor es heterólogo respecto de la secuencia de ácido nucleico que codifica proteína BI1;

(ii) se regenera la planta a partir de las células vegetales; y

(iii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína BI1 se expresa en una cantidad, en al menos un tejido opor un tiempo, de manera suficiente para generar o elevar una resistencia a hongos en la planta en contra de unhongo biotrófico del género Phakopsora, y

(b) selección de la planta o de una parte de una planta en la cual en comparación con la planta de partida o su partegenera o eleva una resistencia contra al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora, en cuyo caso la proteínaBI1 se codifica por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se componede:

(a) las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o, 38; y

(b) secuencias que tienen una identidad de al menos 70% a una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 38, en cuyo caso la planta es soja.

Método para incrementar la resistencia frente a hongos biotrópicos en vegetales

La presente invención se refiere a métodos para generar o incrementar resistencia frente a al menos un patógeno biotrópico del género Phakopsora en una planta de soja o una parte de una planta de soja incrementando la cantidad de proteína o función de al menos una proteína inhibidora 1 Bax (BI-1) en al menos una parte de la planta de soja.

El cultivo de plantas en la agricultura sirve en primer lugar para la producción de alimentos para los seres humanos y para la producción de piensos y forrajes para animales. En los últimos 25 años se han logrado aumentos ostensibles de las cosechas en la producción vegetal. Esto se consiguió mediante interacción de la tecnología de cultivos modificada, nuevos cultivos, abono y, no en último lugar, protección vegetal mejorada. Ante el hecho de una población siempre creciente, la seguridad alimentaria gana en importancia de manera creciente. Se estima que en el año 2017 van a vivir en el planeta 7 millardos de personas. Para alimentarlas sin que aumente la proporción de personas subalimentadas, la producción de alimentos debería crecer en 60 %. (Entrup N.L. et al., Lehrbuch des Pflanzenbaues (Libro de texto de la producción vegetal) , editorial Thomas Mann Verlag, Gelsenkirchen, 2000) . Para esto, una protección vegetal efectiva es un factor decisivo. Los monocultivos en particular, que son la regla hoy en día, son altamente susceptibles a una propagación de las enfermedades del tipo epidémico. La consecuencia son cosechas ostensiblemente reducidas. Hasta ahora los organismos patógenos han sido combatidos ante todo empleando pesticidas. Hoy en día, por contraste, el ser humano tiene la posibilidad abierta de modificar directamente la disposición genética de una planta frente a un patógeno.

Los hongos están difundidos a nivel mundial y forman un grupo heterogéneo con una gran diversidad de especies. Éstos son eucariotas, no poseen clorofila y son, por lo tanto, heterotróficos. Dependen de fuentes de carbono externas de las que se aprovechan como parásitos, saprófitos o simbiontes. Los saprófitos viven exclusivamente en material vegetal muerto. Los hongos parásitos se alimentan de tejidos vivos y deben haber concluido su desarrollo antes de la muerte de la planta. Los parásitos facultativos pueden alimentarse tanto de tejidos vivos como de tejidos muertos. Los simbiontes, como las micorrizas, viven en sociedad estrecha con las plantas. Los hongos poseen uno o más núcleos celulares por célula y son homo- o heterocarióticos. Los hongos tienen una pared celular sólida al menos en un estadio de vida. Esta pared se compone en su mayoría de quitina o en algunos casos como las oomycotas, de celulosa. El cuerpo vegetativo del hongo (talo) es usualmente haploide, en raros casos diploide. El talo de los hongos inferiores (entre otros myxomycotas) se compone de células amibioides o de plasmodios (protoplasma polinuclear desnudo) . Los eumicotes tienen células germinadas, como las levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) , o forman un micelio que se compone de hifas con forma de hebras. Mediante la agregación de hifas pueden formarse órganos especiales para la propagación (cuerpos de fruta) o para supervivencia ante condiciones ambientales desfavorables (esclerocios) . La propagación y multiplicación se efectúan usualmente por medio de esporas; asexualmente, con conidias, uredosporas, esporangiosporas, clamidosporas y zoosporas, sexualmente cono oosporas, ascosporas, zigosporas y basidiosporas.

Hasta hoy se conocen aproximadamente 100 000 especies de hongos diferentes. Entre éstos, solo 5% son fitopatógenos. Los basidiomicotes son una división de los hongos auténticos que se caracterizan por el desarrollo de una estructura particular, el basidio, en el que las basidiosporas maduran. Los basidiomicotes también incluyen los hongos conocidos generalmente como setas y champiñones. Los basidiomicotes son de manera preponderante heterotálicos y auto-estériles. La copulación se efectúa por somatogamia. En tal caso se fusionan dos micelios o esporidios mononucleares, haploides, compatibles. El micelio dicariótico resultante constituye la fase principal del ciclo de vida por un tiempo prolongado. Los dos únicos géneros fitopatógenos de los basidiomicotes son los ustilagos y los uredinales (royas) . Los ustilagos atacan solo angiospermas y poseían antes un gran significado económico. Hoy en día se combaten exitosamente mediante compuestos activos correspondientes y controles estrictos de las semillas. Una importancia más grande tienen hoy todavía los uredinales. Son biotróficos y pueden tener un ciclo de desarrollo complicado con hasta cinco estadios diferentes de esporas (espermacio, acidiosporas, uredosporas, teleutosporas y basidiosporas) . Los uredinales que desarrollan todos los estadios de esporas se denominan como royas macrocíclicas. Si faltan algunos estadios se habla de royas microcíclicas. En el caso de "royas imperfectas" faltan las basidiosporas. Algunas royas cambian el huésped durante su desarrollo. Estos se denominan heteroicos. El cambio de huésped puede estar enlazado con un cambio de fase nuclear. Por contraste, las royas autoicas completan todo su desarrollo en un huésped. Un ejemplo clásico de una roya macrocíclica, heteroica es la roya negra de cereal Puccinia graminis. P. Graminis ataca ante todo trigo en su estadio dicariótico. El haplonte es patógeno para el agracejo (Börner H., Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz (Enfermedades vegetales y protección vegetal) , editorial Ulmer Verlag Stuttgart, 1997; Sitte P. et al., Strasburger - Lehrbuch der Botanik (Texto de botánica) , editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1998; Entrup N.L. et al., Lehrbuch des Pflanzenbaues (Texto de producción vegetal) , editorial Thomas Mann Verlag, Gelsenkirchen, 2000) .

Durante la infección de plantas con hongos patógenos se observan en general fases diferentes. Las primeras fases de la interacción entre los hongos fitopatógenos y sus huéspedes vegetales potenciales son decisivas para la colonización de la planta por parte del hongo. En el primer paso de la infección las esporas se adhieren a la

superficie de las plantas, germinan y el hongo penetra la planta. Para la adhesión de las esporas se requiere un metabolismo activo, que es el caso de Colletotrichum graminicola, o se efectúa de modo pasivo, como en el caso de Magnaporthe grisea. En este último caso, la humedad conduce a la secreción de "adhesivo de mucílago" con el cual se adhiere la espora (Howard R.J. et al., Annu. Rev. Microbiol. 50, 491 (1996) ) . La germinación de espora se induce por inductores no específicos como agua, nutrientes, etileno o, en raras ocasiones como en la Phyllosticta ampelicida, por medio de superficies hidrófugas (Kuo K. et al., Fungal Genet. Biol. 20, 18 (1996) ) . Algunos hongos desarrollan dos tubos de germen, como el mildiú de cereal Blumeria graminis, mientras que otros hongos desarrollan solo un tubo de germen (Green J.R. et al., The powder y mildrews, a comprehensive treatise; The formation and function of infection and feeding structures, APS Press, 2002) . Los hongos pueden penetrar las plantas a través de aberturas ya presentes como estomas, lenticelas, hidátodos y heridas, o penetran la epidermis de la planta directamente mediante fuerza mecánica y con la ayuda de enzimas que digieren la pared celular. Para penetrar en la planta se forman estructuras de infección especiales. Estos órganos de presión se denominan apresorios y permiten que el hongo forme una presión alta sobre un punto discreto. Se estima que la M. Grisea alcanza presiones de 80 bares con su apresorio (Howard R.J. et al., Annu. Rev. Microbiol. 50, 491 (1996) ) . Por el contrario, la mayoría de royas penetran en la planta a través de las estomas. La roya de soja, Phakopsora pachyrhizi, penetra la epidermis de la planta directamente y de esta manera es similar en su conducta de penetración al mildiú de cereal B. graminis (Koch E. et al., Phytopath. páginas 106, 302 (1983) ; Tucker S.L. et al., Annu. Rev. Phytopathol. 39, 385 (2001) ; Green J.R. et al., The powder y mildews, a comprehensive treatise; The formation and function of infection and feeding structures, APS Press, 2002) .

Los hongos fitopatógenos no siempre colonizan toda la planta sino solo determinadas zonas o determinados tejidos. Después de la invasión exitosa de la planta los hongos fitopatógenos siguen diferentes estrategias de alimentación. Los patógenos pertotróficos o necrotróficos matan las células del huésped mediante las enzimas o toxinas extracelulares y se alimentan por la descomposición... [Seguir leyendo]

1. Método para generar o elevar una resistencia frente a al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora en una planta o una parte de una planta, en cuyo caso la parte de una planta comprende un tejido o una célula, el cual comprende los pasos:

(a) elevar la cantidad o función de la proteína de al menos una proteína inhibidora – 1 Bax (BI1) en la planta o al menos una parte de una planta frente a la cantidad o función de proteína en la planta de partida o en sus partes, en cuyo caso

(i) se transforman células vegetales de manera estable con un casete de expresión recombinante que contiene una secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína BI1, en conexión funcional con un promotor, en cuyo caso el promotor es heterólogo respecto de la secuencia de ácido nucleico que codifica proteína BI1;

(ii) se regenera la planta a partir de las células vegetales; y

(iii) la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína BI1 se expresa en una cantidad, en al menos un tejido o por un tiempo, de manera suficiente para generar o elevar una resistencia a hongos en la planta en contra de un hongo biotrófico del género Phakopsora, y

(b) selección de la planta o de una parte de una planta en la cual en comparación con la planta de partida o su parte genera o eleva una resistencia contra al menos un hongo biotrófico del género Phakopsora, en cuyo caso la proteína BI1 se codifica por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se compone de:

(a) las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o, 38; y

(b) secuencias que tienen una identidad de al menos 70% a una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 38, en cuyo caso la planta es soja.

2. Método según la reivindicación 1, en cuyo caso la proteína BI1 comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de al menos 80% con al menos un motivo de consenso BI1 seleccionado del grupo que se compone de

(a) H (L/I) KXVY,

(b) AXGA (Y/F) XH,

(c) NIGG,

(d) P (V/P) (Y/F) E (E/Q) (R/Q) KR,

(e) (E/Q) G (A/S) S (V/I) GPL,

(f) DP (S/G) (L/I) (I/L) ,

(g) V (G/A) T (A/S) (L/I) AF (A/G) CF (S/T) ,

(h) YL (Y/F) LGG,

(i) L (L/V) SS (G/W) L (S/T) (I/M) L (L/M) W, y

(j) DTGX (I/V) (I/V) E.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso el promotor heterólogo es un promotor específico para tejido.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso la expresión de la proteína BI1 se incrementa en una planta al menos en la epidermis, preferible esencialmente de modo específico para el tejido en la epidermis y/o esencialmente no se incrementa en el mesófilo.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso la planta tiene además un fenotipo resistente mlo, o la expresión o la función de MLO, RacB y/o NaOx se inhibe al menos en la epidermis o se reduce

en comparación con una planta de control y/o la expresión o función de PEN2, SNAP34 y/o PEN1 se eleva al menos en la epidermis, en comparación con una planta de control.

Figura 5

Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10