La presente invención se refiere a un método para determinar la producción de especies reactivas de oxígeno en una población celular.

Asimismo, la invención se refiere a un método para determinar la necesidad de una terapia antioxidante de un sujeto masculino y a un método para identificar una sustancia con capacidad de disminuir las especies reactivas de oxígeno presentes en una población celular.

MÉTODO PARA DETERMINAR LA PRODUCCIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN UNA POBLACIÓN CELULAR

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para determinar la producción de especies reactivas de oxígeno en una población celular. Asimismo, la invención se refiere a un método para determinar la necesidad de una terapia antioxidante de un sujeto masculino y a un método para identificar una sustancia con capacidad de disminuir las especies reactivas de oxígeno presentes en una población celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La fertilidad se define como la capacidad que tienen los seres vivos de reproducirse. En base a este concepto, se asume que la esterilidad es la pérdida de esta capacidad y se estima que afecta a un 15% de las parejas en edad reproductora. Aproximadamente, en la mitad de los casos el factor masculino está presente: en un 20% es exclusivamente masculino, el 38% es predominantemente femenino, y en otro 27% se considera mixto mientras que en el 15% restante no se encuentra una causa específica, siendo estos casos clasificados como infertilidad de origen desconocido o idiopática. Según la American Society for Reproductive Medicine (The practice committee of The American Society for Reproductive Medicine, 2006) se considera la infertilidad como una patología siempre y cuando la pareja no consiga concebir en un periodo mínimo de 12 meses. A pesar de esto, entre un 20% -30% consiguen tener descendencia superado este tiempo.

Para el diagnóstico de la infertilidad masculina, además de los principales parámetros que se determinan en el seminograma (concentración, movilidad y morfología espermática) , recientemente se ha empezado a considerar un nuevo parámetro, la fragmentación del ADN espermático. El análisis de la fragmentación del ADN espermático determina la existencia de roturas en una o en las dos cadenas del ADN. Esto ha suscitado un cierto interés debido a que la presencia de estas roturas comprometen la capacidad del individuo para conseguir una descendencia sana al verse alterado el mensaje genético paterno. Efectivamente, en los últimos años, son varios los estudios que demuestran la presencia de un elevado porcentaje de espermatozoides con el ADN fragmentado en individuos infértiles respecto a los individuos fértiles (Evenson DP et al. Theriogenology 15:979-91 (2006) ) . La consecuencia ha sido inmediata en el ámbito del diagnóstico clínico de la infertilidad masculina y se empieza a valorar como marcador de calidad espermática puesto que la fragmentación del ADN ofrece un valor que complementa a los parámetros del seminograma, si bien es cierto que el valor predictivo respecto a la fertilidad es aún objeto de estudio (Zini y Sigman. J Androl. 30 (3) :219-29 (2009) ) .

En la actualidad, los valores que relacionan fragmentación del ADN con bajo potencial de fertilidad "in vivo" o "in vitro" estarían entre un 30-40% de espermatozoides afectados (Evenson DP y Wixon R. Fertil Steril 90 (4) : 1229-31 (2008) ) . En estos casos, el riesgo de abortos recurrentes, fallo en la implantación o de desarrollo embrionario anormal aumenta significativamente (Carrell DT et al. Arch Androl 49 (1) : 49-55 (2003) ) . Por otra parte, cabe esperar que en individuos fértiles y sin otras patologías, el porcentaje de espermatozoides con el ADN fragmentado se sitúe por debajo del 20% mientras que valores intermedios entre el 20% y el 30% de fragmentación estarían indicando una situación anormal si bien aún no se podría relacionar con infertilidad (Erenpreiss J et al. Asian J Androl 8 (1) : 11-29 (2006) ) .

La etiología de la fragmentación del ADN espermático es multifactorial y aunque los mecanismos que provocan estas alteraciones están en parte identificados, no se sabe con absoluta certeza cuál es la procedencia de este daño (Tesarik et al. Reprod Biomed Online 12:715-21 (2006) , Angelopoulo R et al. Reprod Biol Endocrinol 5:36 (2007) ) . No obstante, a nivel intrínseco, se ha propuesto que alteraciones durante la espermiogénesis afectan a la compactación del núcleo espermático, produciendo un estado de vulnerabilidad a ciertas formas de estrés oxidativo que producirían la rotura del ADN (Aitken RJ y De Iuliis GN. Mol Hum Reprod. 2009 Jul 31) .

El estrés oxidativo está considerado como una de las principales causas de fragmentación del ADN espermático. De modo general, por estrés oxidativo se entiende que en el órgano afectado, se está produciendo un desequilibrio metabólico, al no ser capaz el organismo de neutralizar rápidamente las especies reactivas de oxígeno que se producen como consecuencia del constante aporte de energía metabólica que necesita para su actividad. De este modo, al acumularse producen daños en todos los componentes de la célula, entre ellos en el ADN, oxidación de ácidos grasos poliinsaturados y oxidación de aminoácidos en las proteínas.

Diversos estudios han demostrado que las especies reactivas de oxígeno, de origen tanto endógeno como exógeno, pueden inducir la rotura del ADN espermático in vitro o in vivo confirmando el papel que los radicales libres desempeñan en la etiología de la infertilidad masculina (Iwasaki A y col Fertil Steril. 1992;57:409-16, Zini A Int J Androl. 1993;16:183-8, Tremellen K Reprod Update. 2008 May-Jun;14 (3) :243-58) .

Se estima que entre el 25% -50% de los pacientes infértiles presentan concentraciones anómalas de especies reactivas de oxigeno (Twigg J et al., Hum Reprod. 1998;13:1429- 36, Aitken RJ et al., Biol Reprod. 1998;59:1037-46, Sawyer DE Mutat Res. 2003;529:21-34) .

En el caso particular de pacientes diagnosticados con varicocele, principal patología corregible quirúrgicamente y que representa entre 19% -41% de los casos de infertilidad, la presencia de especies reactivas de oxigeno puede ser incluso mayor respecto a otros pacientes infértiles (T. Mostafa et al., Andrologia 41 (2009) , pp. 125- 129, Naughton CK. Et al., Hum Reprod Update 7 (2001) , pp. 473-481) .

Dentro de este contexto, parece obvio que el tratamiento racional con terapias antioxidantes podría ayudar a mejorar la integridad del ADN espermático dado que su principal efecto está dirigido a mantener el equilibrio homeostático mediante la neutralización de especies reactivas de oxigeno. En efecto, varios estudios han demostrado un resultado positivo de ciertos tratamientos con antioxidantes sobre la fragmentación del ADN espermático y otros parámetros seminales de relevancia como son la concentración, movilidad o la morfología espermática (Agarwal A. et al., Reprod Biomed Online. 2004 Jun;8 (6) :616-27., Greco E. et al., J Androl. 2005 MayJun;26 (3) :349-53, Ménézo YJ. et al., Reprod Biomed Online. 2007 Apr;14 (4) :418-21) . Si bien estos estudios son escasos y los tamaños muestrales insuficientes, los datos actuales apuntan a que el tratamiento con antioxidantes orales contribuyen a preservar la integridad del ADN espermático. Idealmente, la administración de tratamientos antioxidantes debería recomendarse tras determinar la presencia de estrés oxidativo en la muestra del paciente.

La determinación de estrés oxidativo en muestras de semen en los laboratorios de andrología no está incluida en la práctica rutinaria porque los métodos actuales son caros, complejos y están poco estandarizados.

En la actualidad existen unos 30 métodos para determinar estrés oxidativo (Ochsendorf FR. Hum Reprod Update. 1999 Sep-Oct;5 (5) :399-420) . Estos métodos se clasifican en métodos directos, indirectos y signos centinelas.

Los métodos directos determinan el daño producido por el exceso de especies reactivas de oxígeno contra los fosfolípidos presentes en la membrana plasmática o en el ADN. Los métodos directos determinan un daño que es el producto final de un desequilibrio entre la producción excesiva de radicales libres y la capacidad antioxidante de la célula. Dentro de este grupo podemos encontrar el test del ácido tiobarbitúrico que requiere de cromatografía de alta resolución (HPLC) o la determinación de isoprostano 8-IsoPGF2a o el ensayo c11-BODIPY. Estos tests son bastante prometedores pero no se utilizan de forma rutinaria por su complejidad.

Los métodos indirectos son por lo general muy sensibles y tienen la ventaja de que los valores de normalidad dentro de controles fértiles e infértiles están relativamente bien determinados. Estos métodos determinan la presencia de especies reactivas de oxígeno (en adelante ERO) en muestras de semen. Las ERO incluyen iones de oxígeno, radicales libres y peróxidos tanto inorgánicos como orgánicos. Son... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la presencia de células que contienen especies reactivas de oxígeno en una población celular que comprende:

a) Poner en contacto en condiciones isotónicas dicha población celular con un agente espesante de forma que se reduzca sustancialmente la movilidad de las células de la población celular y con un compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno, b) mantener la mezcla obtenida en el paso a) durante el tiempo suficiente para la conversión del compuesto indicador en un compuesto detectable en aquellas células que contengan especies reactivas de oxígeno, c) colocar la mezcla obtenida en b) con un agente gelificante sobre un soporte sólido en condiciones adecuadas para que se produzca la gelificación del agente gelificante y d) identificar aquellas células en las que aparece el compuesto detectable en donde la presencia del compuesto detectable en una célula es indicativo de la presencia en dicha célula de especies reactivas de oxígeno.

2. Método según la reivindicación 1 que incluye adicionalmente una etapa b2) que comprende determinar la concentración del compuesto detectable en la muestra obtenida tras la etapa b) en donde un aumento de la concentración de dicho compuesto con respecto a una muestra de referencia es indicativo de la presencia de especies reactivas de oxígeno en dicha población celular.

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2 que comprende adicionalmente una etapa c2) que comprende incubar una muestra de la mezcla de la etapa b en condiciones adecuadas para que se produzca la rotura del espermatozoide y detectar la formación de halos en torno a la cabeza del espermatozoide, en donde la presencia de halos superiores a un determinado valor umbral es indicativo de que dichas células presentan ADN intacto.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que incluye una etapa adicional c3) que comprende teñir las células de la etapa c) .

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el agente que espesante usado en la etapa a) y el agente gelificante usado en la etapa c) es el mismo compuesto.

6. Método según la reivindicación 5 en donde el agente espesante y el agente espesante es agarosa.

7. Método según la reivindicación 6 en donde la concentración final de agarosa es del 1 al 2, 5 % y la etapa b se lleva a cabo durante 45 minutos a 37 ºC.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el compuesto que en presencia de especies reactivas de oxígeno sufre un cambio en sus propiedades de manera que es detectable es una sal de tetrazolio.

9. Método según la reivindicación 8 en donde el compuesto indicador es nitroazul de tetrazolio.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la etapa d) se lleva a cabo por observación directa mediante microscopía óptica.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde la población celular es una población de espermatozoides.

12. Método según la reivindicación 11 en donde la población celular se encuentra formando parte de una muestra de semen.

13. Método para determinar la necesidad de una terapia antioxidante de un paciente que comprende determinar la presencia en una muestra de semen de dicho sujeto de células que contienen ERO usando un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y el porcentaje de células que presentan fragmentación de ADN usando un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12 en donde si el porcentaje de células que comprenden ERO y el porcentaje de células que presentan fragmentación de ADN son superiores a dichos porcentajes en una muestra de referencia es indicativo de que dicho paciente debería ser tratado con una terapia antioxidante.

14. Método según la reivindicación 13 en donde la muestra es una muestra de semen.

15. Método para identificar una sustancia X con capacidad de disminuir las especies reactivas de oxígeno presentes en una población celular que comprende: a) poner en contacto dicha sustancia con dicha población celular, b) Poner en contacto en condiciones isotónicas dicha muestra biológica con un agente espesante de forma que se reduzca sustancialmente la movilidad de las células de la población celular y con un compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno, c) mantener la mezcla obtenida en el paso b) durante el tiempo suficiente para la conversión del compuesto indicador en un compuesto detectable en presencia de especies reactivas de oxígeno, d) colocar la mezcla obtenida en c) con un agente gelificante sobre un soporte sólido en condiciones adecuadas para que se produzca la gelificación del agente gelificante y e) cuantificar la proporción de células en las que aparece el compuesto detectable en donde una disminución de la proporción de células que muestran un cambio en la coloración con respecto a muestra de referencia es indicativo de que la sustancia X es capaz de disminuir en dichas células la presencia de especies reactivas de oxígeno.

16. Método según la reivindicación 15 que incluye adicionalmente una etapa c2) que comprende determinar la concentración del compuesto detectable en la muestra obtenida tras la etapa c) en donde una disminución de la concentración con respecto a una muestra de referencia es indicativo de que la sustancia X es capaz de disminuir la presencia de especies reactivas de oxígeno en dicha población celular.

17. Método según la reivindicación 15 o 16 que comprende adicionalmente una etapa d2) que comprende incubar una muestra de la mezcla de la etapa c con una solución desnaturalizante, seguidamente con una solución de lisis y finalmente

teñir dichas células en donde las células que no muestran halos es indicativo de que dichas células presentan ADN fragmentado.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que incluye una etapa adicional d3) que comprende teñir las células de la etapa d.

19. Método según la reivindicación 15 a 18 en donde el compuesto espesante y el agente gelificante es el mismo compuesto.

20. Método según la reivindicación 19 en donde el compuesto espesante y el agente gelificante es agarosa.

21. Método según la reivindicación 20 en donde la concentración final de agarosa es del 1 al 2, 5 % y etapa c se lleva a cabo durante 45 minutos a 37 ºC.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21 en donde el compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno es una sal de tetrazolio.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 en donde el compuesto que en presencia de especies reactivas de oxígeno sufre un cambio en sus propiedades de manera que es detectable es nitroazul de tetrazolio.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23 en donde la cuantificación se lleva a cabo por observación directa mediante microscopía óptica.

25. Composición que comprende un agente espesante y un compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno.

26. Composición según la reivindicación 25 en donde el compuesto espesante es, además un compuesto gelificante.

27. Composición según la reivindicación 26 en donde el compuesto espesante/gelificante es agarosa.

28. Composición según la reivindicación 27 en donde la agarosa es agarosa de bajo punto de fusión.

29. Composición según cualquiera de las la reivindicaciones 25 a 28 en donde el compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno es una sal de tetrazolio.

30. Composición según la reivindicación 29 en donde la sal de tetrazolio es NBT.

31. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30 en donde el compuesto espesante es agarosa de bajo punto de fusión, el compuesto indicador de ERO es NBT, la agarosa se encuentra a una concentración del 2% al 5% y el NBT se encuentra a una concentración de 1 mg/ml.

32. Kit que comprende un agente espesante, un compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno, una solución ácida que desnaturalice el ADN y una solución de lisis que elimine las proteínas nucleares.

33. Kit según la reivindicación 32 en donde el compuesto espesante es, además un compuesto gelificante.

34. Kit según la reivindicación 33 en donde el compuesto espesante/gelificante es agarosa.

35. Kit según la reivindicación 34 en donde la agarosa es agarosa de bajo punto de fusión.

36. Kit según cualquiera de las la reivindicaciones 32 a 35 en donde el compuesto indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno es una sal de tetrazolio.

37. Kit según la reivindicación 36 en donde la sal de tetrazolio es NBT.

38. Uso de una composición o de un kit que comprende un agente espesante y un compuesto indicador de la presencia de ERO para determinar la presencia de especies reactivas de oxígeno en una población celular.

39. Uso de un kit que comprende un agente espesante, un compuesto indicador de la presencia de ERO, una solución ácida desnaturalice el ADN y una solución de

lisis que elimine las proteínas nucleares para determinar la necesidad de una terapia antioxidante de un sujeto masculino.

40. Uso según la reivindicación 33 o 34 en donde el compuesto espesante es, además un compuesto gelificante.

41. Uso según la reivindicación 35 en donde el compuesto espesante/gelificante es agarosa.

42. Uso según la reivindicación 36 en donde la agarosa es agarosa de bajo punto de fusión.

43. Uso según cualquiera de las la reivindicaciones 33 a 37 en donde el compuesto

indicador de la presencia de especies reactivas de oxígeno es una sal de tetrazolio.

44. Uso según la reivindicación 38 en donde la sal de tetrazolio es NBT.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA 4

FIGURA 5