Consiste en modificar los niveles de acumulación y emisión de monoterpenos y sesquiterpenos en cítricos como mecanismo de resistencia contra patógenos y plagas.

La alteración del contenido de D-limoneno y de otros terpenos se consigue mediante la introducción vía transformación genética de un gen que codifica una enzima con actividad d-limoneno sintasa, bien procedente de un cítrico o bien procedente de otra planta u organismo vivo, en antisentido o en forma de molécula inductora de interferencia de RNA (RNAi). La modificación genética se consigue bien mediante Agrobacterium tumefaciens o cualquier otro método de transformación genética de plantas, a partir de protoplastos o explantes procedentes de la planta. La construcción se incorpora en genotipos cítricos o géneros afines de la familia Rutáceas con el fin de reducir los niveles de acumulación y emisión de dicho monoterpeno y compuestos precursores y/o derivados tanto a nivel de hojas, como de flores y fruto.

Método para conseguir resistencia frente a enfermedades de los cítricos causadas por insectos, por hongos u omicetos o por bacterias o nematodos.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método para conseguir resistencia frente a enfermedades de los cítricos causadas por insectos, por hongos u omicetos o por bacterias o nematodos, especialmente aplicable en el ámbito de la fitopatología, entomología, infecciones de hongos, infecciones de bacterias, tecnología post-cosecha, podredumbres, patógenos de plantas, industria agroalimentaria, características organolépticas, mejora de aroma, mejora de sabor.

Antecedentes de la invención

Las plantas producen una amplia gama de metabolitos secundarios, muchos de los cuales son compuestos volátiles emitidos por las hojas, las flores, las raíces y los frutos con diferentes funciones entre las que se encuentran las de actuar como moléculas señalizadoras en las interacciones de las plantas con otras plantas del entorno o con zonas distantes de la zona emisora de la misma planta, de defensa frente a insectos plaga y frente a patógenos, como atrayentes de insectos predadores de herbívoros en las hojas y en las raíces, como atrayentes de insectos polinizadores por las flores, o como atrayentes de dispersores de semillas por los frutos (Gershenzon y Dudareva, 2007). Además, los compuestos volátiles emitidos por las flores contribuyen de forma fundamental al éxito reproductivo de las plantas y a su supervivencia en ecosistemas naturales (Kessler y col., 2008). Por último, los aromas de las plantas, y más concretamente de sus frutos, han contribuido enormemente a la selección de los mejores genotipos y a su utilización por el hombre con fines nutricionales, medicinales e industriales (Goff y Klee, 2006).

En los últimos tiempos se ha avanzado considerablemente en el conocimiento de las rutas biosintéticas, en la clonación de genes reguladores importantes, en la purificación de enzimas implicadas y en el descubrimiento de los mecanismos reguladores que conducen a la formación de estos compuestos volátiles y a su emisión por los diferentes tejidos u órganos de las plantas. Consiguientemente, se ha propuesto la utilización de los conocimientos adquiridos para la mejora de las plantas mediante ingeniería genética con fines principalmente agronómicos y nutricionales.

Los cítricos son los árboles frutales de mayor importancia económica en el mundo, con una producción que excedió los 105 millones de toneladas en 2008 en una superficie superior a los 7,6 millones de Ha. (FAO, 2009). Se cultivan en más de 130 países en zonas tropicales y subtropicales (hasta 40º de latitud a ambos lados del ecuador) en las que se dan condiciones edafoclimáticas favorables. Los mayores productores son Brasil, EE.UU., China, España y México, que representan aproximadamente el 55% de la citricultura mundial.

Los cítricos se ven afectados tanto por plagas importantes como por enfermedades causadas por nematodos, hongos, omicetos, bacterias, espiroplasmas, fitoplasmas, virus, viroides y por enfermedades de etiología desconocida. Algunas de estas enfermedades afectan a la mayoría de áreas citrícolas, como las causadas por el omiceto Phyto- phthora sp. o por el virus de la tristeza de los cítricos también conocido como Citrus Tristeza Virus (CTV), que impiden el uso de determinados excelentes portainjertos y que restringen la producción y la calidad de la fruta en ciertos países. Otras, como la cancrosis, causada por la bacteria Xanthomonas citri subesp. citri, y que afecta a la mayoría de variedades importantes, se encuentra ampliamente expandida y actualmente constituye una seria amenaza para las citriculturas de Florida y de la mayoría de países sudamericanos. Otras enfermedades se encuentran localizadas en áreas geográficas específicas, como las producidas por la bacteria Xylella fastidiosa en Sao Paulo (Brasil). Finalmente, hay enfermedades que han sido localmente importantes y que en tiempos recientes se han propagado por otras zonas citrícolas, como es el caso del Huanglongbing, causado por la bacteria Candidatus Liberibacter spp., que afecta a todas las variedades. Esta bacteria ha impedido el desarrollo de una industria citrícola en países del sudeste asiático y actualmente está matando a millones de árboles en Florida y Brasil. En el caso de las tres bacterias mencionadas, no existen medios eficaces de control. También hay enfermedades muy importantes durante el mantenimiento post-cosecha de los frutos, como las producidas por hongos del género Penicillium.

Referente a las plagas, las hay que afectan directamente al árbol y/o a la fruta producida, como la mosca del mediterráneo (Ceratitis capitata) o el piojo rojo de California (Aonidielia aurantii), y las que son transmisoras de enfermedades, como la psila Diaphorina citri, transmisora de las bacterias Candidatus Liberibacter spp., o el pulgón Toxoptera citricidus, muy eficaz transmisor de CTV. Aunque actualmente se utilizan fundamentalmente agresivos tratamientos agroquímicos para el control de las plagas de los cítricos, éstos no suponen una solución duradera, ni económica ni ecológicamente sostenible a medio plazo.

Ante estas serias amenazas de la citricultura en todo el mundo, resulta prioritaria la búsqueda de soluciones alternativas, como las basadas en la mejora genética. A pesar de los esfuerzos realizados en los programas de mejora genética tradicional a lo largo de más de un siglo, la citricultura actual está basada en un pequeño grupo de variedades de excelente calidad que se injertan sobre una gama no demasiado amplia de portainjertos. La gran mayoría de estos genotipos se han producido al azar, es decir se han conseguido a partir de la selección de mutaciones espontáneas detectadas en el campo por los agricultores o a partir del cultivo de semillas y germinación de plantas de interés de manera fortuita. Además, los programas de mejora se ven muy limitados por la compleja biología reproductiva de los cítricos. En este contexto, la modificación genética mediante transgenia ofrece enormes posibilidades para la mejora, ya que permite introducir caracteres únicos en genotipos élite sin alterar su fondo genético. Aunque existe controversia social sobre el uso de esta tecnología para la mejora de las plantas, consideramos que el uso de transgenes de interés procedentes del propio cítrico que se desea modificar superaría las reticencias de ciertos sectores y más aún si la estrategia propuesta resultase superior en términos medioambientales a las que se emplean actualmente para el control de plagas y patógenos.

En la última década, se ha publicado una serie de trabajos fundamentales sobre el papel de los compuestos volátiles de las plantas como repelentes de plagas y como atrayentes de predadores de herbívoros (Aharoni y col., 2003; Arimura y col., 2000; De Moraes y col., 2001). Esto llevó a pensar que era posible modular la emisión de volátiles por las plantas mediante ingeniería metabólica con fines de mejora de la respuesta de defensa de las plantas frente a plagas. Así, la sobreexpresión del gen precursor de una linalol/nerolidol sintasa de fresa en plantas transgénicas de Arabidopsis condujo a la acumulación de altos niveles de linalol y consiguientemente a la inducción de repelencia frente a pulgones (Aharoni y col., 2003). La sobreexpresión de este mismo transgén en Arabidopsis, pero esta vez dirigido a la mitocondria, condujo a la acumulación de nerolidol y un homoterpeno derivado, (E)-DMNT, que hizo a las plantas atrayentes de insectos predadores carnívoros, enemigos naturales de ácaros plaga (Kappers y col., 2005). En este mismo sentido, la sobreexpresión del gen precursor de una sesquiterpeno sintasa, TPS10, en plantas transgénicas de Arabidopsis las hizo atrayentes de abejas parásitas de insectos plaga, debido a la emisión a altos niveles de sesquiterpenos que se liberan normalmente cuando las larvas de esas abejas mastican las hojas (Schnee y col., 2006). Más recientemente, la sobrexpresión del gen precursor de una trans-cariofileno sintasa de orégano en maíz transgénico hizo a las raíces de las plantas atrayentes de nematodos que las protegen del ataque de coleópteros plaga (Degenhardt y col., 2009). La sobreexpresión en tabaco transgénico del gen de una pachulol sintasa junto a la del gen de una farnesil difosfato sintasa, precursora de sesquiterpenos, condujo a una elevada acumulación de pachulol y otros 13 sesquiterpenos, que hicieron a las plantas muy resistentes a larvas de insectos plaga (Wu y col., 2006).

1. Método para conseguir resistencia frente a enfermedades de los cítricos causadas por insectos, por hongos u omicetos o por bacterias o nematodos caracterizado porque consiste en la incorporación mediante transformación genética de un transgén que codifica un transcrito antisentido o activador de RNAi frente a ARN mensajero/s de al menos un polipéptido endógeno con actividad d-limoneno sintasa, de modo que se reduce la actividad d-limoneno sintasa endógena y la acumulación de d-limoneno a niveles que activan la respuesta de defensa de la planta frente a patógenos.

2. El método de la reivindicación 1ª, caracterizado porque la secuencia precursora del gen de interés que codifica una enzima con actividad d-limoneno sintasa procede de Citrus spp. o de la familia Rutáceas.

3. El método de la reivindicación 1ª, caracterizado porque el transgén de interés comprende sólo una parte del gen endógeno cuya expresión se pretende silenciar, o la secuencia completa pero con al menos una mutación de la secuencia nucleotídica, o la secuencia con inserciones o deleciones, de modo que en cualquier caso se reduzca o bloquee la expresión del gen precursor de al menos una d-limoneno sintasa endógena en las células transformadas genéticamente.

4. El método de la reivindicación 1ª, caracterizado porque la reducción de la actividad d-limoneno sintasa y la bajada en la acumulación y emisión de d-limoneno conlleva la alteración drástica del perfil de contenido y emisión de terpenos volátiles en frutos, hojas, flores o en todos los tejidos de las plantas, tales como monoterpenos, sesquiterpenos u otros derivados de los precursores geranil difosfato, farnesil difosfato o geranilgeranil difosfato, de manera que se sintetizan nuevas combinaciones de aromas y nuevos aceites esenciales con nuevas propiedades industriales, farmacéuticas y médicas.

5. El método de la reivindicación 1ª, caracterizado porque los transgenes de interés se encuentran clonados bajo el control de promotores fuertes y constitutivos, para reducir los niveles de d-limoneno sintasa en todas las células de las plantas transformadas.

6. El método de la reivindicación 1ª, caracterizado porque los transgenes de interés se encuentran clonados bajo el control de su propio promotor y terminador o bajo el control de regiones promotoras y terminadoras específicas de tejido o inducibles, con objeto de reducir los niveles de acumulación del monoterpeno d-limoneno y alterar los de otros compuestos volátiles.

7. El método de la reivindicación 1ª, caracterizado porque los transgenes de interés se incorporan a plantas del género Citrus o Rutáceas mediante transformación genética de células o tejidos y regeneración de plantas enteras mediante organogénesis o mediante embriogénesis somática.