Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas.

Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta,

caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO endógena se reduce en comparación con plantas tipo natural o células de planta, respectivamente; en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 4 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos de los mismos, o en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4 o fragmentos de los mismos.

Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas Antecedentes de la invención La presente invención se relaciona con un método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, así como también con el uso de una molécula de ácido nucleico para la producción de estas plantas y/o células de planta. En estas plantas, el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO se altera en comparación con las plantas tipo natural. Adicionalmente, la solicitud se relaciona con plantas transgénicas y/o células de plantas que tienen una resistencia aumentada contra la roya de la soja y con vectores de expresión que comprenden una secuencia que es idéntica, homóloga o complementaria a una secuencia que codifica un MLO funcional o no funcional o fragmentos de los mismos.

Las plantas se confrontan permanentemente con microbios patogénicos. Las enfermedades de la planta provocadas por diversos patógenos, tales como virus, bacterias y hongos, de una parte pueden conducir a pérdidas sustanciales de cultivo en el crecimiento de plantas cultivadas, con consecuencias económicas, pero de otra parte también poseen una amenaza a la seguridad alimenticia de los seres humanos. Se han utilizado fungicidas químicos desde el último siglo para el control de enfermedades provocadas por hongos. Aunque el uso de estos agentes conduce a una reducción en el grado de enfermedades de planta, hasta ahora no se puede descartar que estos compuestos puedan tener efectos perjudiciales en los seres humanos, en animales y el medio ambiente. Con el fin de reducir el uso de pesticidas tradicionales a un mínimo, es por lo tanto importante examinar la defensa natural del patógeno de diversas plantas a diferentes patógenos, y para hacer además de los métodos de siembra clásicos, el uso sistémico de ingeniería genética, tal como al introducir genes de resistencia externos, o al manipular la expresión del gen endógeno en plantas para la producción de plantas resistentes a los patógenos.

La resistencia significa de manera general la capacidad de una planta para evitar, o por lo menos reducir la infestación y colonización por un patógeno perjudicial. Se pueden discernir diferentes mecanismos en la resistencia que ocurre en forma natural, con la que las plantas se defienden de la colonización por organismos fitopatogénicos. Estas interacciones específicas entre el patógeno y el anfitrión determinan el curso de la infección (Schopfer and Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, Springer Verlag, Berlin- Heidelberg, Alemaina) .

Con respecto a la resistencia específica de la raza, también llamada resistencia del anfitrión, se hace una diferenciación entre las interacciones compatibles e incompatibles. En la interacción compatible, ocurre una interacción entre un patógeno virulento y una planta susceptible. El patógeno sobrevive, y se puede construir en las estructuras de reproducción, mientras muere el anfitrión. De otra parte ocurre una interacción incompatible cuando el patógeno infecta la planta pero se inhibe en el cultivo antes o después del desarrollo débil de los síntomas. En el último caso, la planta es resistente al patógeno respectivo (Schopfer and Brennick, vide supra) . En las interacciones compatible e incompatible ocurre una reacción específica y defensiva del anfitrión al patógeno.

Sin embargo, en la naturaleza, esta resistencia al anfitrión se supera frecuentemente debido al desarrollo evolutivo rápido de los patógenos (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 No. 7: 626-633) . En contraste con esto, la resistencia del no anfitrión ofrece protección permanente, amplia y fuerte de los fitopatógenos. La resistencia del no anfitrión significa el fenómeno que un patógeno puede inducir una enfermedad en una cierta especie de planta, pero no en otras especies de planta (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259-264) .

A pesar de estas características interesantes, hasta ahora solo se han entendido pobremente las bases genéticas y biológicas para la resistencia del no anfitrión. Existen indicaciones que la resistencia al no anfitrión se induce por agentes no específicos, y también que las proteínas del patógeno individual induce la reacción de la resistencia del no anfitrión (Heath (1981) Phytopathology 71: 1121-1123; Heath (2001) Physiol. Mol. Plant Pathol. 58: 53-54; Kamoun et al. (1998) Plant Cell 10: 1413-1425; Lauge et al. (2000) Plant J. 23: 735-745; Whalen et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6743-6747) . El fenómeno de resistencia de no anfitrión también se puede basar en las propiedades estructurales o químicas de las especies de la planta, tales como el grosor de la cutícula o la presencia de sustancias inhibidoras.

A pesar de la resistencia con base en las barreras físicas desarrolladas, el sistema de defensa de no anfitrión más efectivo de la planta se representa por el reconocimiento de las estructura microbianas moleculares conservadas, también llamadas PAMP (patrones moleculares asociados con patógenos) . El reconocimiento de los PAMP por un receptor PAMP activa una cascada de señalización que conduce a la activación de una multitud de mecanismos de resistencia, que incluyen fortificación de la pared celular, secreción de compuestos tóxicos y muerte celular programada. Aquellos mecanismos de defensa son suficientes para detener efectivamente los intentos de ataque de la mayor parte de microbios. Esta respuesta inmune innata es una parte integral del grupo durable y genéticamente complejo de mecanismos de defensa de resistencia del no anfitrión.

Solo unas pocas especies de patógenos parecen tener mecanismos específicos involucrados para eludir o para bloquear el sistema de defensa básico de las especies individuales de planta, y, como una consecuencia, ha llegado a tener patógenos de estas especies. Es concebible que la dirección y la manipulación de las proteínas anfitrionas particulares es una etapa clave de este sabotaje de defensa específico de las especies.

Moho polvoriento es una enfermedad fúngica común de muchas plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas como remolacha, diversos cereales, cohombro, lechuga, zanahoria, guisantes, tomate, fresa, manzana, uvas etc. los hongos Moho polvoriento (Er y siphales) pertenecen a la división de Ascomycota. Blumeria graminis es el hongo que provoca moho polvoriento en los pastos. El hongo moho polvoriento de la cebada (Blumeria graminis f.sp. hordei, Bgh) es un patógeno biotrófico obligado que ataca las células epidérmicas de la cebada (Hordeum vulgare L.) . Después del contacto de la espera con la cutícula de la hoja de cebada, se forma un apresorio. La siguiente etapa y la etapa crucial de invasión fúngica es la penetración de la pared celular seguido por el establecimiento de una estructura de carga intracelular especializada llamada "haustorio" que no destruye la integridad de la membrana de plasma.

En la cebada monocotiledónea, la presencia de isoformas de la familia de las proteínas MLO localizadas en la membrana de plasma heptahelicoidal se requiere para la penetración exitosa de la pared celular del anfitrión por el hongo moho polvoriento. La ausencia de estas proteínas MLO, provocada por variaciones genéticas naturales o lesiones inducidas en los genes mlo respectivos, resulta en falla de las esporas fúngicas para penetrar la pared celular de la planta. Todos los genotipos de la cebada que carecen de un gen funcional mlo son resistentes a todos los aislados conocidos del moho polvoriento de cebada. Adicionalmente, la resistencia mlo heredada recesivamente es extremamente durable bajo condiciones de campo. Se ha utilizado mutación MLO en la mayor parte de variedades de cebada de primavera en Europa durante los últimos 25 años.

La proteína MLO es una proteína localizada en la membrana de plasma integral y contiene siete dominios de transmembrana hidrófobos. El terminal C citoplásmico tiene una hélice a amfifílica que sirve como un dominio de unión calmodulina, que es necesario para la actividad completa de la proteína MLO. La unión de calmodulina dependiente de calcio a este dominio de péptido se muestra in vitro e in vivo y contribuye a cerca de la mitad de la actividad que confiere susceptibilidad del mlo (Kim M.C. Nature. 2002 Mar 28; 416 (6879) :447-51) .

El gen ror2 (requerido para resistencia 2 mlo) que, cuando muta, suprime la resistencia mediada por mlo, se encuentra que codifica una sintaxina residente de la membrana de plasma, una proteína que pertenece a la superfamilia de las proteínas SNARE. La... [Seguir leyendo]

1. Método para aumentar la resistencia contra la roya de la soja en plantas transgénicas y/o células de planta, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos una proteína MLO endógena se reduce en comparación con plantas tipo natural o células de planta, respectivamente; en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 4 o sus partes funcionalmente equivalentes o fragmentos de los mismos, o en donde por lo menos una proteína MLO endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene por lo menos 75 % de homología con la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4 o fragmentos de los mismos.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la transferencia de por lo menos una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia que es idéntica, homóloga o complementaria a la secuencia o secuencias que codifican el MLO endógeno o fragmentos del mismo a las células de planta.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque una parte de la molécula de ácido nucleico transferida es por lo menos 50 %, preferiblemente por lo menos 60 %, más preferiblemente por lo menos 70 %, especialmente preferiblemente por lo menos 80 %, particularmente preferiblemente por lo menos 90 %, y más preferiblemente por lo menos 95 % homóloga a la secuencia que codifica el MLO endógeno o fragmentos del mismo.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la reducción del contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se logra mediante interferencia de ARN (ARNi) , una construcción anticodificante, una construcción de co-supresión, activación del gen post-transcripcional (PTGS) , una construcción P de ribonucleasa, recombinación homóloga, una construcción de ribozima o activación del gen inducido por el virus (VIGS) .

5. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un MLO no funcional o un fragmento del mismo que tiene por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque por lo menos una mutación de punto, eliminación y/o inserción del MLO no funcional evita la función celular de MLO, y especialmente inhibe la interacción de MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un anticuerpo recombinante que es específico para por lo menos un MLO endógeno y que evita la función celular del MLO, y que inhibe especialmente la interacción del MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido y/o la actividad de por lo menos un MLO endógeno se reduce mediante la expresión de por lo menos un inhibidor MLO que evita la función celular de por lo menos un MLO, y que inhibe especialmente la interacción del MLO con sus patrones de unión patogénicos o fisiológicos, especialmente con Ror2 y/o calmodulina.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el MLO es un MLO de planta seleccionado del grupo que consiste de Hordeum vulgare (cebada) MLO, Or y za sativa (arroz) MLO, Arabidopsis thaliana MLO, preferiblemente AtMlo1, AtMlo2, AtMlo3, AtMlo4, AtMlo5, AtMlo6, AtMlo7, AtMlo8, AtMlo9, AtMlo10, AtMlo11, AtMlo12, AtMlo13, AtMlo14 o AtMlo15, Linum usitatissimum (lino) MLO, Triticum aestivum (trigo) MLO, Glycine max (soja) MLO, preferiblemente GmMlol, GmMlo2, GmMlo3.1 o GmMlo3.2, o un MLO que es esencialmente funcionalmente equivalente a una cualquiera de dichas proteínas MLO.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el MLO se selecciona del grupo que consiste de un MLO que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, o un MLO que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente funcionalmente equivalente a cualquiera de las secuencias MLO descritas en la SEQ ID NOs: 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48.

11. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las plantas son plantas dicotiledóneas tales como soja, algodón, colza, tomate, remolacha azucarera, papa, girasol, guisantes,

plantas ornamentales, tabaco, trébol (Trifolium spec.) , Kudzu (Pueraria lobata) , árboles y legumbres tales como Alfalfa, y especialmente soja.

12. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las plantas son plantas monocotiledóneas tales como Hordeum (cebada) , Avena (avena) , Triticum (trigo) , Secale (centeno) , Or y za (arroz) , Sorghum (mijo) , Zea (maíz) , Panicum, Pennisetum, Setaria y similares.

FIGURAS

Figura 2a Figura 2b Figura 2c Figura 2d