MÉTODO PARA AISLAMIENTO DE POLIPÉPTIDOS SOLUBLES.

Un método de identificación de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana,

que comprende:

a. obtener una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL;

b. permitir la infección de un césped bacteriano por el fago de la biblioteca; y

c. identificar fagos que forman calvas mayores en el césped bacteriano;

d. aislar el fago de la calva mayor en el paso (c) de la reivindicación 1; y

e. determinar la secuencia de otras características de los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL expresados por el fago de la calva mayor.

Metodo para aislamiento de polipeptidos solubles Campo de la invención Esta invención se refiere al aislamiento, identificación y manipulación de polipeptidos, especialmente fragmentos 5 mon6meros de anticuerpos humanos.

Antecedentes de la invención Los anticuerpos en los vertebrados se componen tipicamente de cadenas pesada (H) y ligera (L) apareadas. El primer dominio de las cadenas H y L combinadas, el VH y VL, son de secuencia mas variable, y esta es la porción del anticuerpo que reconoce el antigeno y se fija al mismo. Los dominios VH y VL reconocen el antigeno como un par.

El repertorio inmunológico de los Camelidos (camellos, dromedarios y llamas) es unico en el sentido de que posee tipos raros de anticuerpos a los que se hace referencia como anticuerpos de cadena pesada (Hamers, Casterman C. et al., 1993) . Estos anticuerpos carecen de cadenas ligeras y por tanto sus sitios de combinación estan constituidos por un solo dominio, denominado VHH.

Los anticuerpos VHH recombinantes de un solo dominio (sdAbs) proporcionan varias ventajas sobre los fragmentos FV monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Si bien los sdAbs son comparables a sus contrapartidas scFv en terminos de afinidad, los mismos superan a los scFv en terminos de solubilidad, estabilidad, resistencia a la agregación, susceptibilidad de replegado, rendimiento de expresión, y facilidad de manipulación del DNA, construcción de bibliotecas y determinaciones estructurales 3-D. muchas de las propiedades mencionadas de los scAbs VHH son deseables en aplicaciones que implican anticuerpos.

Sin embargo, la naturaleza no humana de los VHHs limita su uso en inmunoterapia humana debido a inmunogenicidad. A este respecto, los sdAbs VH y VL humanos son candidatos ideales para aplicaciones de inmunoterapia debido a que se espera que sean menos inmun6genos.

Los VHs y VLs humanos, sin embargo, son por lo general tendentes a agregación, una caracteristica comun a los VHs y VLs derivados de anticuerpos convencionales (Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward E.S. et al., 1989) . Por ello, se han realizado intentos para obtener VHs y VLs humanos adecuados para aplicaciones de anticuerpos. Tales VHs y VLs han exhibido tambien otras propiedades utiles tipicas de los VHHs tales como alto rendimiento de expresión, alta susceptibilidad de replegado y resistencia a la agregación. Bibliotecas sinteticas construidas a base de estos VHs y VLs como andamiajes de biblioteca podrian servir como una fuente prometedora de proteinas terapeuticas.

La camelización y la llamización, que implican incorporar residuos importantes de solubilidad de los VHHs de camello y llama, respectivamente, en VHs o VLs humanos se han empleado para generar VHs y VLs humanos mon6meros. Se ha demostrado que bibliotecas sinteticas de sdAb construidas sobre la base de estos VHs y VLs y generadas por aleatorización de la CDR son funcionales en terminos de producción de ligantes para diversos antigenos (Davies, J. et al., 1995; Tanha J. et al., 2001) .

En otro enfoque, se aislaron VHs y VLs mon6meros totalmente humanos de bibliotecas sinteticas humanas de VH y VL sin recurrir a ingenieria de la clase arriba mencionada. En un experimento, se descubri6 un VH humano mon6mero cuando una biblioteca de VH humano se lav6 en batea contra lisozima de huevo de gallina (Jespers, L. et al., 2004b) . Mas recientemente, un metodo de selección basado en criterios de desplegado reversible y afinidad produjo un gran numero de VHs mon6meros a partir de bibliotecas humanas sinteticas de VH (Jespers, L. et al., 2004a) . Este descubrimiento puso de manifiesto el hecho de que un metodo de selección apropiado es fundamental para la captura eficiente de VHs humanos mon6meros raros con propiedades biofisicas deseables.

Objetos de la invención Un primer objeto de la invención es proporcionar un metodo de cribado de alta potencia para identificación de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana.

45 Sumario de la invención Se proporciona un metodo para identificación de fragmentos de anticuerpo VH y VL humanos estables. El metodo incluye los pasos de obtención de una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y VL, permisión de la infección de un cesped bacteriano por el fago de la biblioteca, e identificación de fagos que forman calvas mayores que el tamafo medio en el cesped bacteriano. Se aislan luego 50 los fagos de las calvas de mayor tamafo, pudiendo determinarse la secuencia u otras caracteristicas de los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL expresados por los fagos de las calvas mayores.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un metodo de identificación de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana, que comprende a) obtener una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL, b) permitir la infección de un cesped bacteriano por el fago de la biblioteca y c) identificar fagos que forman calvas mayores que el tamafo medio en el cesped bacteriano.

Descripción Detallada de los Dibujos Leyendas de las figuras Figura 1. Una representación grafica de los resultados de ejemplos seleccionados: el contraste en el tamafo de calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquellos que presentan uno insoluble (BT32/A6) . La fotografia muestra una parte de la placa de agar de cesped bacteriano que se ampli6 para mejorar la visualización de la calva. Aunque la placa contenia un numero igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografia contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamafo grande. La mayoria de las calvas BT32/A6 eran demasiado pequefas para producir imagenes claras bien definidas en la fotografia. Por tanto, las calvas marcadas por flechas representan una proporción menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamafos de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciación del DNA.

Figura 2. Secuencia de aminoacidos de los VHs humanos seleccionados sobre la base de la afinidad para la proteina A y el tamafo de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoacidos con HVHP2M10 o HVHP44. Se incluyen guiones para alineación de las secuencias. Los residuos en las posiciones de solubilidad principales y el residuo 57T que se asocia con VHs/VHHs con la propiedad de fijación de proteina A se muestran en negrilla. Se utiliza el sistema de numeración Kabat. El valor de la "frecuencia" total es 114

CDR = región determinante de la complementariedad; FR = región de entramado; gln seq = secuencia de la linea germinal Figura 3. Tendencias de agregación de los VHs humanos. Cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización de un VH humano aislado en este estudio (HVHP428) con el de un VHH de llama (H11C7) y un VH humano tipico (BT32/A6) . El pico que se eluye en ultimo lugar en cada cromatograma corresponde al VH mon6mero. El pico H11C7 dimero esta marcado por una flecha. B, espectros 1H NMR unidimensionales de HVHP414 a 800 MHz (i) , HVHP423 a 500 MHz (ii) y HVHP428 a 800 MHz (iii) . Los espectros en el panel izquierdo estan aumentados a escala con un factor de dos a fin de permitir una mejor observación de las sefales de baja intensidad.

Figura 4. Estabilidad de los VHs humanos en terminos de su resistencia a tripsina a 37º C y su integridad despues de incubación larga a 37º C. A, SDS-PAGE que compara las movilidades del VH HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina a los 15, 30 y 60 min con relación a un marcador de 21 kDa. HVHP414-cMyc denota VH de HVHP414 que carece del c-Myc. B, perfiles de masa molecular obtenidos por espectrometria de masas de VH de HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina (60 min) . El perfil de la espectrometria de masas del VH tratado se ha superpuesto al correspondiente al del VH sin tratar para proporcionar una mejor comparación visual. La masa molecular experimental del VH sin tratar es 14.967, 6 Da, que es esencialmente identica a la masa molecular esperada, 14.967, 7 Da. La masa molecular observada del VH tratado con tripsina (13.368, 5 Da) indica la perdida de 13 aminoacidos en el termino C por escisión en K (Lys) en la etiqueta de c-Myc para dar una masa molecular esperada de 13368, 0 Da. El sitio de escisión de tripsina se muestra por una flecha vertical encima de la secuencia de aminoacidos de HVHP414. C, cromatogramas de filtración en gel que comparan... [Seguir leyendo]

1. Un metodo de identificación de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL humanos estables diana, que comprende:

a. obtener una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de fragmentos de anticuerpo VH y/o VL;

b. permitir la infección de un cesped bacteriano por el fago de la biblioteca; y

c. identificar fagos que forman calvas mayores en el cesped bacteriano;

d. aislar el fago de la calva mayor en el paso (c) de la reivindicación 1; y

e. determinar la secuencia de otras caracteristicas de los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL expresados por el fago de la calva mayor.

2. Un metodo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual los fragmentos de anticuerpo VH y/o VL diana son solubles.

3. Un metodo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual los fragmentos de anticuerpo diana VH y/o VLson mon6meros.

4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo diana VH y/o VL son no agregantes.

5. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo diana VH y/o VL se expresan fuertemente.

6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el fago es un fago filamentoso.

7. Un metodo de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual el fago es M13 o fd.

8. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL tienen alta eficiencia de replegado termico.

9. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL mantienen su funcionalidad despues de incubación larga a 37º C.

10. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL son resistentes a las proteasas.

11. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL tienen una vida util larga a 4º C y/o a la temperatura ambiente y/o a 37º C.

12. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL son funcionales en ambientes intracelulares.

13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los fragmentos de anticuerpo estables VH y/o VL son capaces de ser funcionales cuando se administran internamente a humanos.

FIGºRA 10